作文模版大绵羊BMPRADAMTS 1基因多态性及不同组织间差

PCR-SSCP技术和直接技术对影响绵羊产羔数的BMPR-IB基因和ADAMTS-1遗传多态性进行分析，并利用生物信息学分析法对绵羊的产羔数进行相关联分析；运用实时荧光定量技术对ADAMTS-1在绵羊不同组织进行表达量分析，对于影响繁殖力候选ADAMTS-1在转录水平进行1绵羊BMPR-IB编码区864位点多态性及产羔数相关分试验羊品种出现三种型AAABBB，该编码区第846位点发生C>T高山细毛羊母羊AB型频率略高于AA型四种绵羊的优势等位均为A。小尾寒羊、高山细毛羊、湖羊三种绵羊χ2值和G2值均未达到显著水平(p>0.05),而羊的χ2值和G2值达到显著水平(P<0.05)，说明除了羊95%PIC多态信息含量可知，属于低度多态的是小尾寒羊和湖羊(PIC<0.25)，而在羊和高山细毛羊信息含量处于中度多态(0.25<PIC<0.5)。显著性检验分析表明：，山细毛羊与小尾寒羊、湖羊羊与小尾寒羊、湖羊中差异呈现显著(P<0.05)。BMPR-IB编码区第846位点突变在不同繁殖力母羊群体中分布不同，该位，2绵羊BMPR-IB3′部分非编码区多态性及产羔数相关分3413′部分非编码区扩增发现第511位点杂合C>T在CG型中非编码区544位点杂合C>G，发现三种型CC、CT、CG。群体中不同型对于产羔数影响不显著，而CT型对于高山细毛羊产羔标3绵羊ADAMTS-1在不同组织间差异表达及第五外显子多态性分绵羊8个组织进行表达量分析可知，所有群体的表达量显著高于其他组下丘脑。发现小尾寒羊多羔的表达量是羊双羔母羊的1.54倍、羊单羔母羊的2.61倍。通过对ADAMTS-1第五外显子分析可知，在编码区出现C1506T、G1509A，均属于同义突变，三种带型分别命名为AA、AB、AC，显著性分析可知三种型均对产羔数不显著。所有绵羊群体χ2检验表明均处于Hardy-weinberg平衡状态，PIC值属于低度中度多态(0.25<PIC<0.5)。所得数据表明ADAMTS-1对于羊和小尾寒羊产羔数有重要的影响，初步认定是羊和小尾寒羊的多胎主效。绵羊；BMPR-IB；ADAMTS-1；产羔数；PCR-SSCPThelittersizeofsheepisanimportanteconomiccharacterwhichcandeterminethebenefitofraisingsheep.Butthelittersizeisakindoflowheritabilitythresholdtrait,theconventionalbreedingmethodsgeneticimprovementprogresshasbeenslow.AtpresentThenewtypebiotechnology,especially,molecularmarkershasasignificanteffectonearlyselectionofsheep,whichimprovetheefficiencyandaccuracyofselection.ThisexperimentusingPCR-SSCPanddirectsequencingofBMPR-IBgeneandADAMTS-1genegeneticpolymorphismysisoftheeffectoffecundityofsheep,Andysisoflittersizeinsheepwereassociatedwithbiologicalinformationysis,TheexpressionofADAMTS-1geneindifferenttissuesofsheepwasyzedbyreal-timefluorescent tativetechnique,andtheeffectofADAMTS-1geneonthetranscriptionlevelwasverified.Inordertoprovidetheoreticalbasisforimprovingthefecundityofsheep.Resultsareas1ysisofPolymorphismat864LocusofBMPR-IBGeneCDSRegionandItsRelationshipwithLitterSizeinSheepBreedsTheresultsshowedthattherewerethreekindsofgenotypeAA,ABandBBintestedsheepbreeds,andC→Tmutationoccurredincodingregionof846.AAwasthedominantgenotypeinSmallTailHanewesandHuewes,whileABwasthedominantgenotypeinMongoliaewesandGansualpinemerinoews.Awasthedominantallelesinallfoursheepsamples.Theχ2andG2valuesofSmallTailHanewes,GansualpinemerinoewesandHuewesdidnotreachedthesignificantlevel(p>0.05),buttheχ2andG2valuesofMongoliaewesreachedthesignificantlevel(P<0.05),whichindicatedthatthreeotherewesallfittedwithHardy-WeinbergequilibriumexceptMongoliaewes.TheobservedvalueFoffoursheepbreedsinBMPR-IBgenewereinthe95%confidenceinterval,andclosertotheon-line.AccordingtothePICamongdifferentbreedswecouldgetthatSmallTailHansheepandHusheepbelongtolowpolymorphism(PIC<0.25),whileMongoliasheepandGansualpinemerinosheepbelongtomoderatepolymorphism(0.25<PIC<0.5).SignificanttestshowedthatGansualpinemerinosheephadsignificantdifferenceswithSmallTailHansheepandHusheep,andMongoliasheephadsignificantdifferenceswiththeotherthreesheepbreeds(P<0.05).Themutationoccurredin846siteinBMPR-IBgenecodingregiondistributeddifferentlyinewegroupswithdifferentfecundity,whichmeantthatthislocuscouldbeconsideredasapotentialmolecularmarkerinsheep.2ysisofPolymorphismatPartial3′UTRBMPR-IBGeneandItsRelationshipwithLitterSizeinSheepBreeds341sheepinthreesheepbreedstotal,usingpolymorphismdetectionin3sheep'partofthenonencodingregionwasamplified,511heterozygousC>TinCGgenotype,544heterozygousnonencodingregionofC>G,foundthreegenotypesofCC,CT,CG.InAlpineMerinoewesgroup,CTgenotypehasasignificanteffectonlittersize,anddifferentgenotypesintheothertwogroupsinthelittersizewasnotaffected,butthegenotypeofCTinsheeplambingmarkerneedsfurthervalidation.3DifferentialExpressionofSheepADAMTS-1GeneinDifferentTissuesandysisofExon5PolymorphoismTheysisofexpressiontyof8organsindicatedthattheexpressionofovaryinallgroupswassignificantlyhigherthanotherorgans,andtheexpressionleveloftherestorgansrankedfromhightolowwaskidney,heart,liver,lung,spleen,pituitary,andhypothalamus.TheexperimentshowedthattheovaryexpressionofADAMTS-1geneinSmallTailHanewes(multiple-births)was1.54and2.61timesofthatinMongoliaewes(twinbirths)andMongoliaewes(singlebirth)respectively.BasedontheADAMTS-1exon5geneysis,wefoundthatC1506TandG1509AappearedintheCDSregion,whichbothbelongedtothesynonymousmutation.ThreebandswerenamedasAA,ABandAC,andthesignificantysisindicatedthatthesethreegenotypeswerenotsignificantonlittersize.Theresultsofχ2fitnesstestshowedthatallsheeppopulationswereinHardy-weinbergequilibriumstate,andPICvaluebelongedtointermediateandmoderatepolymorphism(0.25<PIC<0.5).TheresultsofthisexperimentindicatedthatADAMTS-1geneyedanimportantroleonthelittersizeofMongoliaewesandSmallTailHanewes,whichwaspreliminarilyconsideredastheprolificacymajorgeneofthe1.1繁殖力作为畜牧业生产的重要经济性状对于家畜而言繁殖力就是生产关联候选已经得到广泛的应用[1]。，绵羊是最早被驯化的物种之一[2100人类随着自身所需选择出各类优质遗传资源的绵羊品种。在农业生产当中羊的15.8%(,2013)数产双羔或者多羔因此增加绵羊每胎的产羔数是提高生产效益非常有效的措施，具有重要的意义。，部分优良用国外品种被引入国内后其中二代之后的杂种群体的繁殖性能直展，越来越多与绵羊差高数相关的候选与分子标记被发现，作为标记辅助选择（marker-assistedselection，MAS）在繁殖育种的实际应用上积累了丰富的基[3]节且产单羔这类情况严重制约了我国绵羊产品我国养羊也的发展[3]。如果绵羊的常年和高繁殖力是养羊业对于绵羊产业且遗传进展极为缓慢[4]。之前人们利用传统的育种方式进行绵羊繁殖性状的改Booroola羊[3。上述品种都具备常年且一胎多羔的优良性状。绵羊的品种不同表现出来的繁殖力也不尽相同，通常情况下北方牧区140%。小尾寒羊和湖羊作为我国优良的高繁殖力地方品种，一般能一年产两胎或者两年三胎，双羔多见，多的每胎产4至5与自然选择，使与繁殖力相关的高产候选发生分离或者流向集中，最终导致1..2.2羊进行短期优饲对于提高母羊率有很大的帮助备孕母羊的维生素缺乏会导致数减少。1.2.3母羊的产羔随 的增加而增加，初产母羊的平均产羔数显著低于经产羊，3-65-67岁物种的遗传多样性，利用遗传多样性规律有利物变异和一系列相关应用。A发展和广泛的应用[5]。截至目前，根据生物大分子的不同，广义的分子标记可AA标记。：存在与否及在间表达的差异可以反映出群体的遗传状况其蛋白质的标记主要包括两类蛋白的标记和同工酶酶标记法。利用同工酶在组中对应基因座的具置，同工酶标记可以划分为：等位同工酶和复等位同工酶。：DNA技术的不同DNA标记可以分为以下三类：第一代，利用限制性内切酶和SouthernPCRSNP[9-11]。RFLP（Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）标记法是利用限制性内切酶（Restrictionenzyme,RE）把生物的同源片段进行特利用这些长短不一的片段反应DNA分子上不同酶切位点分布状况，最早是由Grodzicker等[12]1974建立的第一代分子标记技术，RELP标记优点有稳定性良好、等位的共显性、可以标记大量位点等。RELP技术中存在的不足例如组DNA多态性的探针难以寻找，操作复杂繁琐。检测周期过于冗长RELP技术中的缺点，加快了检测的速度和效率。PCR-SSCP1984年Noumi[14]等对大肠杆菌野生型和突变型F1-ATPase利用非变性移率有差异，根据这一研究结结果为变异的检测提供了理论基础和技术支持。而后在1989年，Orita等[15,16]人利用这项技术进行多态性的检测，并年对电泳后的凝胶染色进行了改良，提出利用银染法可以快速便捷的判定型，从此PCR-SSCP技术建立并且日趋纯熟。PCR-SSCP（Polymerasechainreaction-singlestrandconformationalpolymorphism）DNARNA80PCR技术进行检测的第三代分子标记技术。其原理是利用软件设计某一物种组DNA分子PCR设备进行目的片段特异性扩增，而后用扩增的目的片段在高温（99℃）DNA差异导致其迁移率有一定的差异呈现出不同的带型。目的片段任意一条单链DNA中碱基序列出现变异(碱基的替换、缺失或者插入)都能导致单链构象的改的辅助意义，避免盲目导致经费浪费[18,19]。RAPDRAPDPCR技术的发展建立起来的，Wnliams和Welsh1990年分DNA多态检测技术[20,21]。RAPDDNA多态性的独特RAPD基本原理是利用一系列随机排列的寡聚核酸单链（8～10个碱基）为一个引物再通过PCR对靶DNA组进行随机扩增扩增产物利用凝胶电泳RAPD技术特点：（1）RAPDDNA样品量较少、灵敏度高，PCR引物退火温度低且允许一定的程序错配，RAPD引物的通用性较好可以适用于不同生物组分析，每次反应只需要一个引物就可以扩增出许多片段，（4RAPDRAPD技术的不足：RAPD技术不足：（1）RAPD检测因素较多，其DNA模版浓度、Mg2+浓度、实验重复性差和稳定不高[25]；（2）RAPD问题，不同出现大小一致条带后，并不能说明不同拥有一条同源DNARAPD技术的应用受一定的制约[27]BMPR-IB研究进作为转移生长因子β亚基(TGF-Β)受体的成员之一的骨形态受体蛋白IB，耳、骨骼、、下丘脑、等组织中都有较高的表达，同时参与 morphogeneticprotein-2)、BMP-4、BMP-6、BMP-15的信号转导(LeeWSetal,2004)[28]。绵羊的BMPR-1B序列CDS区域长度为1509bp，编码区共编码502个氨基酸残基，并被定位于绵羊第6号的4q22-23区间。BMPR-IB明BMPR-IB被确定为绵羊高繁殖效候选，新西兰和法国学者发现Booroola绵羊BMPR-IB在编码区发生A>G突变导致氨基酸子发生改BMPR-IBBMPR-IB蛋白受体部分失活，最终导致其功能无法正常进行(MulsantPetal,2001,SouzaCJHetal,2001,WilsonTetal,2001)[29-31]FecBBooroola绵羊拥有较高的繁殖力。在此次发现之后FecB在其他绵羊品种都有证实，Garole羊群(HanrahanJPetal2004)[32]。2003年，我国的湖羊与小尾寒同样也出现（军垦型（华等，2010）[34]小鼠敲除BMPR-IB则会导致小鼠不育，可能是因为缺失型小鼠的Mishina发现缺失BMPR-IB的小鼠会出现生产不规律的周期和假孕现象，同时还观察到细胞周围的颗粒细胞数目明显少于野生型的小鼠-IB缺失突变导致小鼠颗粒小包分泌芳香化酶能力显著减弱，在动物合成雌激素的在mRNA转录水平也有明显的减弱，环加氧酶在诱导卵丘生长过程中起着关键的作用，缺失此类酶缺失是导致体内不孕的原因之一。的机制。BMP-4、BMP-15、GDF-9和BMPR-IB对于绵羊的影响较为明显，其功能主要表现在孕酮分泌起到抑制作用或者对颗粒分化的调控，BMPR-IB是影响动物繁殖力的主效因子。对于深入研究骨形态发生蛋白及受体，尤其是BMPR-IB对于培养高繁殖力动物提供有力的理论依据，ADAMTS-1研究进、哺乳动物的解聚蛋白样金属蛋白酶ADAMTS(a andmetalloproteinasewiththrombospondin-likemotifs,ADAMTS)中共有十九降解、生成、血管生成、止血过程、关节炎和等[37]。哺乳动物的解聚蛋白样金属蛋白酶ADAMTS(a thrombospondin-likemotifs,ADAMTS)中共有十九个蛋白水解酶构成参与了多种病理与生理学的过程其中例如外基质的组装和降解生成血管生成止血过程、关节炎和等。近年来的相关研究发现，各类与ADAMTS-1有着紧密的联系ADAMTS-1可以影响肿瘤转移和增生在[38,39]、结肠癌[40]、肺癌[39]和软骨癌[41]等一系列都有ADAMTS-1的发现。ADADMTS成员最早是作为小鼠炎症上调，其没有跨膜结构域并且存在I型TSP基序[42,43]。ADAMTS-1作为成员之一，是在小鼠结肠26、；cDA序列[44]s1可以分泌到细胞外并且与细胞外基ECM蛋白调节[45,46]s-1-末端金属蛋白酶亚结构与ECM蛋白合，降解蛋白聚糖、蛋白多糖和多功能蛋白聚糖[47，-1与血管的发生有重要的关联是因为MT-1可以与血管内皮生长因子结合，进而影响血管的生长[48]。在心血管疾病研究中[49]，例如动脉硬化[50，心肌梗塞[38][51]TS-1对上述疾病存在着一定的关联。s-1对孕酮的合成有一定的影响，并且可以合成孕酮。其L/HCG的合成有很大的关系，与此同时在颗粒细胞的表达直接影响囊状的生成在卵丘细胞中的表达与细胞中也有s-1的表达，且对细胞的能育性有关系[52]。Richars等[47]用小鼠为试验样本并且敲除s-1，结果表明被敲除ts-1的雌鼠与对照组相比，敲除s-1的雌鼠官畸形和繁育能力低下，导致其壁变厚，且存在许多旋绕内出现大量的异常发育的包囊较对照组成熟数量下降明显，导致不能，注射hCG与G后不孕等。此类现象只发生在雌鼠中，而公鼠并不影响其繁殖性能[53]可知s-1过调节过程的发生在雌性动物中起着重要的作用。；近年来，在国内鲍建军等[54]以小尾寒羊、洼地绵羊、羊和湖羊为试验样本，通过ADAMTS-1的外显子SNP位点与产羔性状进行分析研究。等[55]和[56]等以黔北麻羊、黑和半细毛羊为试验对DNASNPs位点的突变对基RNAADAMTS-1可能会影响产羔性状。PE公司在1995年研发成功并具有意义的荧光定量PCR技术，此项Real-TimePCRPCRPCRCtCt值(CyclePCRPCR的扩增产物量，同时cDNA标准品进行梯度稀释，再对这些Real-timePCRCtReal-timePCR定量分析法可以大致分为两类，分别是相对定量分析法和绝对定量分析法相对定量分析法广泛应用与拷贝数的变化检测中还有目的的mRNA表达水平的检测领域中。而绝对定量法主要应用在以及其他寄生相对定量分析（Relative相对定量的方法是利用未处理过的样品和处理过后的样品之间的目的表利用内参进行标准化处内参是指一类在各类样本中拷贝数基本不变的核酸序列常用的内参β-actin、GAPDH、ACTB、SDHA、28sRNA1、18sRNA等。cDNA合成率的差异等。如果不进行统一标准话处理得到的数据差异就会很大计算每一个待测样本与校正样本的目的和内参的比值从而得到一个比例，如下样本的相对浓度目 的浓内 的浓可以校正同一批次实验中不同样本数量和质量之间的差异[60]目标及内参在不同批次的检测过程中可能会因为探针复性淬灭目的及内参不同批次的检测过程会出现一些因为探针复性淬灭系PCR反应提供一个恒定的校正点。：

利用此类处理的目的是,可以对不同批次和不同时间的实验样本进行恒定的校正，能够准确校正时间和时间、批次和批次的多次实验结果中的差异。(1)2－△△Ct2-△△Ct分析是在Real-timePCR最为常见的一类分析方法。此类方法的特点是假定目的和内参的扩增效率都为100％（每个循环增加一倍的产物数量5％PCR①用待测样本（校准样本）内参的Ct值归一待测样本（校准样本）的目的的Ct值ΔCt(sample)=Ct(target,sample)－Ct(reference, 用校正样本的ΔCt归一待测样本ΔCtΔΔCt=ΔCt(sample)－ΔCt(calibrator)=2－△△Ct（2target：目的reference：内参sample：待测样本；calibrator：校对照组验通过分析绵羊产羔性状与绵羊BMPR-IB和ADAMTS-1多态性位点关系，及ADAMTS-1实时荧光定量分析法对不同羊品种组织间差异表达量第二章绵羊BMPR-IBCDS区864位点多态性及所需的羊由省永昌县养殖示范户提供，小尾寒羊由陇西县菜子镇旺旺母羊养殖农民专业合作社提供，高山细毛羊由张掖市肃南县畜牧站提供，湖羊由武威三洋农牧公司提供。羊只均为2~3岁、产羔胎次2~3胎的成年经产母羊。颈静脉血样，肝素钠抗凝采血管-20°C保存备用。双丙烯酰胺（Bis）、十二烷基硫酸钠（SDS）、TrisView核酸均购自全式金生物（）；PCR扩增所需引物由苏州生物科技合成。DNA（1）ACD1.4712g0.4809g1.3205g，加100mL。ACD1:7，现配现用。（2）1mol/LTris-HCl12.11gTris80mLHCl调pH8.0100mL，高压灭菌备用。100mL。Tris-HCl1mL100mL。氯仿:异戊醇（24:1）：24:1的比例混匀，置于棕色瓶中TE（pH8.0）：1mol/LTris-HCl10mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0）2mL，加100mLpH8.0，高压灭菌，4℃保存。PCR（pH8.0），100mL（2）10×TBE108gTris碱，55g硼酸，40mL0.5mol/L（pH8.0），1000mL（3）1×TAE缓冲液：50×TAE1:49（4）1×TBE缓冲液：10×TBE1:9（5）1.0%1g100mL1×TBE缓冲液中，加热使（6）2.0%2g100mL1×TBE（8）10%1g10mL超纯水溶解，4℃SSCP2冲液：98%1960µL，0.5mol/LEDTA40µL，二甲苯0.025%，溴酚蓝0.025%。固定液：50mL无水乙醇，2.5mL500mL显影液：7.5gNaOH，2.0mL，加水定容至250mL影效果较好；未特别部分的为蒸馏水；高压灭菌条件为：121℃，1.1绵羊血液本试验用羊血样均为颈静脉采血，ACD抗凝，生物冰袋低温，-20℃保存绵羊组DNA的提绵羊血液组DNA提取方法参照本课题组改进的常规饱和酚抽提法。如下500µL1.5ml继续向离心管中加入1000µL细胞裂解液，为了使细胞充解剧烈震2-4min,46000rpm5min；(4)3;300µL5-(24:1)4℃6000rpm500µL1000µL的预冷无水DNA沉淀析出，4℃13000rpm2min；5µL1%琼脂糖凝胶电泳检测，剩余-20℃冷冻保存备用。绵羊血液DNA1.0g100mL1×TAE电泳至55℃时备用。凝胶液与混匀。水品状态），轻摇凝胶槽保证凝胶液均匀分布与槽中。置于室温10-20min，待1×TAE电3～5mm。加样品事前准备一只干净平整的PE手套，利用移液枪吸取1µL5×DNALoadingbuffer5µL待测样溶液，利用移液枪充分使二者混匀，最后将混好样品加入琼脂糖凝胶的梳孔中，在边缘的梳孔中加入DL2000LadderMarke100V电压下15-25min。首先用超纯水/RNase-ddH2O将石英比色皿润洗，用镜纸将水吸干利用TE/RNase-ddH2O校正紫外分光光度计吸取5µL待测DNA/RNA溶液，并用TE溶液/RNase-ddH2O稀释至3mL，280nm260nmODDNA/RNADNA（µg/µL）=OD260×50×稀释倍数/1000DNAOD260/OD280OD260/OD280>2.0RNAOD260/OD280≈1.8DNAPCRBMPR-IB多态性位点引物设根据已经公布的绵羊BMPR-IBmRNA序列（GenBank登录号: .1），结合本试验步骤2.6.1的试验结果，对BMPR-IB部分多态位点进行引物设计（P1）引物序列见表2.2.3.。Table2.3PolymorphismLociPrimerofBMPR-IBPCRPCR扩增效率的因素有很多例如退火温度、模版的浓度、模版的质量、镁离子的浓度等。PCR反应的优化是为了获得最佳扩增效率的条件，而且还要PCRPCR25µLdd 10×PCRLoadingBuffer Primer Primer Taq 模板 共 PCR2.4PCRTable2.4TheBestamplifiedreactionprogramofPCR2.2.3.1。PCR1×TBE电泳缓冲液。7uL的变性剂，3uLPCRPCR管中混匀。混匀后的样10°C，140V，18mA，3W，4固定结束后，加入适量的银染液，在摇缓慢摇动7min。再用蒸馏水漂洗2.6Table2.6FormulofPolyacrylamide根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，人工判断型PCR2对造成。PCR频率和型频频 p(A)

q(B)

其中：p(A):是等位A的频率，q(B)：是等位B的频率，nAAnAB、nBB分别指该群体中AA、AB和BB型的数型频率是指一个群体中某一特定型的数占全部数的比率闭的间随机交配的群体中频率和型频率在世代交替过程中Hardy-WeinbergP=p2H=2pqQ=q2nAB′=(nAA+nAB+nBB)HnAA′=(nAA+nAB+nBB)PnAB′=(nAA+nAB其中：p=(2nAA+nAB)/[2(nAA+nAB+nBB)]，q=(2nBB+nAB)/[2(nAA+B的频率。nAA、nAB和nBB分别为该群体中AA、AB和BB型的数nAB′、nAA′nAB′nAA、nABnBBHardy-Weinbergχ2

n

1=OiEi

=OiEi2 矫

i Ei：理论期望值；Oi：实际观察值；n：等位群体纯合度（Homozygosity，Ho）、杂合度(Heterozyosity，He)、有效等位基因数(HeterozyosityNe)和多态信息含量(polymorphisminformationPIC)是评价群体内遗传多样性的指标。（He

HoHoi

；

HeHe1i有效等位iNe i中，Ne为有效等 数，Pi为第i个有效等 频率多态含当PIC>0.5时属于高度多态，0.25<PIC<0.5属于中度多态，PIC<0.25属于低度 m1PIC1P22P2i

i1j将DNA组样品，用1.2%琼脂糖凝胶检测(2-1)。条带单一无杂带，说明DNA完整性较好，可以进入下游试验。Figure2-1GenomicDNAdetectionofsheepBMPR-IBPCR目的产物扩Figure2-2P1PCRamplificationofBMPR-IBgeneinPCR-SSCPSSCPP1和B两个等位，并且存在3种带型，分别为AA、BB、AB(图2-3)图2-3绵羊BMPR-IBSSCP检Figure2-3SSCPdetectionofBMPR-IBgenein2.4.4为了保证试验所得的可靠性，将AA、BB、AB带型的样品各取两份送去公司发现1020位点(编码区864)出现突变C→T序列比对及峰值(图2-4、2-5)Figure2-4ThecomparisonofBMPR-IBgenecodingsequencesofinAA BB AB图2-5绵羊BMPR-IBAA型、AB型、BB型比Figure2-5SequencecomparisonofAA,ABandBBgenotypesofsheepBMPR-IB2.4.5频率和型频对于四种绵羊品种(小尾寒羊多羔、湖羊多羔、羊单双羔和高山细456SSCP2-1)。湖羊母羊以及小尾寒羊母羊的优势型均为AA型而羊母羊和高山细毛羊母羊AB型频湖羊三种绵羊χ2值和G2值均为达到显著水平(p>0.05),而羊的χ2值和G2值达到显著水平(P<0.05)。说明除了羊其他三种羊均达到Hardy-weinberg平衡状态。四种绵羊的观测值F在BMPR-IB中均处于95%置信区间内，且接PIC和湖羊(PIC<0.25)，而在羊和高山细毛羊信息含量处于中度多态(0.25<PIC<0.5)(2-2)。表2-1型和频Table2-1Genotypeandallele2-2Table2-2Geneticpolymorphism2.4.6、、、、、、利用SPSS21.0软件对BMPR-IB的编码区864位点的三种不同的分布差异性检测(表2-3)。检测所得可知在高山细毛羊单羔和小尾寒羊多羔之间、高山细毛羊单羔和羊单羔之间、高山细毛羊单羔和羊单羔之间高山细毛羊单羔和羊双羔之间高山细毛羊单羔和湖羊多羔之间高山细毛羊双羔和小尾寒羊多羔之间高山细毛羊双羔和羊单羔之间高山细毛羊双羔和湖羊多羔之间羊单羔和湖羊多羔之间、蒙古羊双羔和湖羊多羔之间差异极显著(P<0.01)。高山细毛羊双羔和羊双、、、、、、、之间羊单羔和羊双羔之间、湖羊多羔和小尾寒羊多羔之间分布差异不、表2-3不同型在绵羊品种中的分布差异检Table2-3Testofthedistributionofdifferentgenotypesinsixsheep注AAP>0.05,AB0.01<P<0.05,ACP<0.01。表P值Note:AAreferstonosignificantdifference(P>0.05),ABreferstosignificantdifference(0.01<P<0.05),ACreferstoextremelysignificantdifference(P<0.01).ThedataintablerepresentPvalue2.4.7BMPR-IB多态性与产羔性状分在不同型间最小二乘积所得如下。AA型、AB型、BB型之间的最2.4703(1.2166)、1.7347(0.8357)、1.3846(0.5064)3.199(0.0015)ABBB1.490(0.1377)。不同型与品种互作效应的最小二乘积分析，3种型与四种绵羊有种互做效应(羊小尾寒羊湖羊无BB型)(表4)高山细毛羊×AA(1.3684高山细毛羊×AB(A×AB)1.377 6、小尾寒羊×AA(S×AA)3.0000、小尾寒羊×AB(S×AB)3.0000、湖羊×AB(H×AB)3.5333。不同型与品种之间互作效应后多重比较(表4)，A×ABA×AA之间、A×BBA×AA之间、A×ABA×BB之间、A×AA与P0.05P0.001。表2-4品种与型互作与不同产羔类型绵羊分布差异的独立样本检Table2-4Testofin ctionaleffectofbreedandgenotypeineweswithdifferentlaming注：A×AA高山细毛羊×AA型;A×AB高山细毛羊×AB型;A×BB高山细毛×BB型;S×AA小尾寒羊×AA型;S×AB小尾寒羊×AB型;M×AA羊×AA型;M×AB羊×AB型H×AA湖羊×AA型H×AB湖羊×ABNote:A×AAindicatesGansualpinemerinoewesandAAgenotype;A×ABindicatesGansualpinemerinoewesandABgenotypy;A×BBindicatesGansualpinemerinoewes×BBgenotypy;S×AAindicatesSmallTailHanewes×AAgenotypy;S×ABindicatesSmallTailHanewes×ABgenotypy;M×AAindicatesMongoliaewe×AAgenotypy;M×ABindicatesMongoliaewe×ABgenotypy;H×AAindicatesHuewes×AAgenotypy;H×ABindicatesHuewes×ABgenotypyBMPR-IB在多种组织中都存在BMPR-IB的表达是调节和分化的重要蛋白受体。近年来，研究表明，BMPR-IB对于的调节主要在于抑制其分泌酮或控制颗粒细胞的分化成熟，进而间接动物的繁殖(Yietal.,2001)[61]。FecB突变是发生在绵羊BMPR-IB编码区746位(A→G)突变，从而导致携带该突变 数提高，研究推测其突变可能导致对激素的敏感程度提高(Montgomeryetal.,1992)[62]。也有研究表明该突变导致激素的分泌水平提高(Montgomeryetal.,2001)[63]。但是其配体的多样，通路复杂，功能多样，目前对其调节机制并不能确定而且目前研究中对于绵羊编码区中的同义突变较少本实验通过利用了直接法和PCR-SSCP技术对高山细毛羊单双羔、羊单双羔、小尾寒羊多羔和湖羊多羔的BMPR-IB编码区864位T→C突变进行关联性的分析。发现456只绵羊中，都存在AA型和AB型，而在BBChu等(2011)[64]试验所得不同，等位均是A，而频率中小尾寒羊和湖羊的优势均为AA，在羊量可知，属于低度多态的是小尾寒羊和湖羊(PIC<0.25)，而在羊和高山记位点，对提高选育高产羔率的绵羊有一定的价值。G2χ2适合性检测表明，不同母羊产羔性状与型相关性分绵羊的繁殖性状属于低遗传力性状之一主要原因是由于主效与微效基因相节控制的对于寻找主效多胎品系以此提高绵羊的繁殖性能有着重要的意义，BMPR-IB是作为湖羊、小尾寒羊等高繁殖性能绵羊的主效(东等，2005)[65]Q249R突变，本次试并且存在三种型AA，AB，BB。该点突变属于同义突变，并没有引起氨基小尾寒羊、湖羊，羊与小尾寒羊、湖羊中差异呈现显著(P<0.05)。高山细毛羊和羊之间的差异也存在显著性(0.01<P<0.05)但在高繁殖力绵羊品种湖羊与小尾寒羊中差异并不明显(P>0.05)。利用品种和产羔数互作后与型做况下导致颗粒细胞的分化和细胞的发育(Kimchi-Sarfatyetal.,2007)[66]。因864突变可作为控制绵羊繁殖性状的分析标记位点。456BMPR-IB的第八外显子中发现编码区864位C→T突变，发现三种型AA、AB、BB。其中只有在高山细毛羊中发现BB型，而其他群体均只有两种型AA、BMPR-IB在不同繁殖力绵羊品种中间差异明显，其是否是可以作为绵羊产第三章绵羊BMPR-IB部分3端非编码区多态2.2.1试验样品2.2.2DNA的提取2.2.3绵羊血液样品的检测本试验中所用引物均利用Olig6.0和Primer5.0引物设计软件相合而设计BMPR-IB3端非编码区引物设根据已经公布的绵羊BMPR-IBmRNA序列（GenBank登录号: .1），结合本试验步骤2.6.1的试验结果，对BMPR-IB部分多态位点进行引物设计（P2）引物序列见表3-1。表3-1BMPR-IB部分多态位点引Table3-1PolymorphismLociPrimerofBMPR-IBPCRPCR同第二章PCR同第二章PCR同第二章同第二章绵羊血液组的提同第二章BMPR-IBPCR目的产物扩BMPR-IB引物P2引物扩增产物条带清晰无杂带（图3-1），大小分别为150bp符合预期大小图3-1绵羊BMPR-IB引物P2PCR产Figure3-1P2PCRamplificationofBMPR-IBgeneinPCR-SSCPSSCPP2A和B两个等位，并且存在3种带型，分别为CC、CT、CG(图3-2)图3-2绵羊BMPR-IBSSCP检Figure3-2SSCPdetectionofBMPR-IBgeneinCC、CT、CG带型的样品各取两份送去测序公司，三种型CC、CT、CG进行分析，在CT型中，BMPR-IB非编码区第511位点杂合C>T，在CG型中，非编码区544位点杂合C>G（3-4）。 图3-4绵羊BMPR-IBCC型、CT型、CG型比Figure3-4SequencecomparisonofCC,CTandCGgenotypesofsheepBMPR-IB频率和型频对于三种绵羊品种(小尾寒羊多羔羊单双羔和高山细毛羊单双羔)共计341样本SSCP分析所得如下(表3-2)。三种绵羊的优势等位均为C。甘肃高山细毛羊双胎、羊单胎绵羊χ2值和G2值均未达到显著水平(p>0.05),而羊双胎、高山细毛羊单胎、小尾寒羊多胎的母羊χ2值和G2值达到显著水平(P<0.05)。说明羊双胎、高山细毛羊单胎、小尾寒羊多胎母羊群体Hardy-weinberg平衡状态。三种绵羊的观测值F在BMPR-IB中均处于95%多态的是高山细毛羊单胎母羊(0.25<PIC<0.5))，其余绵羊群体均为高度多态(PIC>0.5)(3-3)。表3-2型和频Table3-2Genotypeandallele3-3Table3-3Geneticpolymorphism、三种型分布差异检测(表3-4)。高山细毛羊单羔和高山细毛羊双羔高山细毛羊单羔和羊单羔之间、高山细毛羊单羔和羊双羔之间差异极显著(P<0.01)。高山细毛羊单羔与小尾寒羊多羔之间差异显著、(0.01<P<0.05)。其余组之间差异不显著(P>0.05)表3-4不同型在绵羊品种中的分布差异检Table3-4Testofthedistributionofdifferentgenotypesinfivesheep注AAP>0.05,AB0.01<P<0.05,ACP<0.01。表P值Note:AAreferstonosignificantdifference(P>0.05),ABreferstosignificantdifference(0.01<P<0.05),ACreferstoextremelysignificantdifference(P<0.01).ThedataintablerepresentPvalue在不同型间最小二乘积所得如下。CC型、CT型、CG型之间的最小二乘积及标准差分别为1.63(0.689)、1.96(0.723)、1.50(0.675)。两两进行独TCTCC、CG3.512(0.0005)、4.328(<0.0001)。CCCG1.456(0.1470)。不同型与品种互作效应的最小二乘积分析，3种型与三种绵羊9种互做效应(表3-5)。高山细毛羊×CC(A×CC)1.49、高山细毛羊、×CT(A×CT)1.64、高山细毛羊×CG(A×CG)1.23、小尾寒羊×CC(S×CC)3.0000小尾寒羊×CT(S×CT)3.0000小尾寒羊×CG(S×CG)3.000羊、、、 、、之间互作效应后多重比较(4)，A×CCA×CT之间、A×CCM×CC之间、A×CCM×CT之间、A×AAM×CG之间、A×CTM×CC之间、A×CT与M×CT之间、A×CTM×CG之间、A×CTM×CC之间、S×CCS×CT之间、S×CCS×CG之间、S×CTS×CG之间、M×CCM×CG之间、M×CC之间、A×CGM×CC之间、A×CGM×CG之间差异显著(0.05<P<0.01)，其P0.001。表3-5品种与型互作与不同产羔类型绵羊分布差异的独立样本T检Table3-5Testofin ctionaleffectofbreedandgenotypeineweswithdifferentlaming注：A×CC高山细毛羊×CC型;A×CT高山细毛羊×CT型;A×CG高山细毛×CG型S×CC小尾寒羊×CC型S×CT小尾寒羊×CT型S×CG小尾寒羊×CG型M×CC羊×CC型;M×CT湖羊×CT型;M×CG羊×CGNote:A×CCindicatesGansualpinemerinoewesandCCgenotype;A×CTindicatesGansumerinoewesandCTgenotypy;A×CGindicatesGansualpinemerinoewes×CGgenotypy;S×CCindicatesSmallTailHanewes×CCgenotypy;S×CTindicatesSmallTailHanewes×CTgenotypy;S×CGindicatesSmallTailHanewes×CGgenotypy;M×CCindicatesMongoliaewe×CCgenotypy;M×CTindicatesMongoliaewe×CTgenotypy;M×CGindicatesMongoliaewe×CGgenotypy。、的3′端非编码序列在转录后的加工起着调控的作用，其中涉及了mRNA的稳定性及翻译效率等一系列生理进程的调节，国内外目前关于对BMPR-IB的非编码序列鲜有涉及[67,68]。贾立新等[69]对BMPR-IB基因部分3′非编码区序列进行直接和PCR-SSCP技术检测高繁殖力和低繁殖而在其余三种绵羊（小尾寒羊、特克羊和中国美利奴绵羊）并没有发现这类突变。目前研究认为，在转录调控区域主要集中在的5′端，也就5′包含3′mRNA的转录后和翻译水平的调控并非必须[70]。的3′端非编码区包含大量的碱基有着丰富的遗传信息[70]3′miRNA主要来源，抑制靶序列的转录和翻译产物的合成[71]3′端非编码区序的过程[72,73]，对于雄性哺乳动物的形成有一定的调节作用[74,75]。本次试PCR-SSCP33′511544位点两个位置额点突变进行了多态性的检测分析。结果表明，3341个样本中，存在3种型，CC型、CT型和CG型，在3′非编码序列第511位点和544位点发生了C>T突变和C>G的突变，第430bp到580bp扩增后三种型分布差异检测高山细毛羊单羔和高山细毛羊双羔高山细毛羊单羔和羊单羔之间、高山细毛羊单羔和羊双羔之间差异极显著(P<0.01)。。、在不同型间最小二乘积所得如下。CC型、CT型、CG型之间的区扩增发现，发现三种型CC、CT、CG。在高山细毛羊母羊群体中，CT型对于产羔数有显著影响，而在其他两第四章绵羊ADAMTS-1在不同组织间差异表达试验所需的羊由省永昌县养殖示范户提供，小尾寒羊由陇西县菜子镇母羊养殖农民专业合作社提供，颈静脉血样，用ACD抗凝管-20°C保存；另外分别期的羊单羔母羊(4只)、羊双羔母羊(4只)和小尾寒羊多羔母(4只)的、垂体、下丘脑、心脏、脾脏、肺脏、肝脏、RNATapDNADNAMaker宝生物公司(大连)雷磁PHST-4A型pH计（精密科学仪器）、SartoriusAA-160型电子读数天平（赛多利斯仪器系统）、NanoVue分光光度计（GESigmaABICTYD0.5-10CTYD10-100CTYD200-1000，英国）、高速冷冻离心机（BiofugeSrats，热电），凝胶成像系统（Bio-BET140E，SM）、电热恒温鼓风干燥（G-9146A精宏恒温水浴（P-DHS-5065-B，）、电动移液器（BioMate，热电）、冰箱（-219，青岛海尔），-1000型紫外分光光度仪（NnoDrop）等。荧光定量PR仪：RocheLightycler480PRPR所需的仪器设备。绵羊组DNA的提绵羊血液组DNA提取方法参照本课题组改进的常规饱和酚抽提法。如下500µL1.5ml继续向离心管中加入1000µL细胞裂解液，为了使细胞充解剧烈震2-4min,4℃6000rpm5min；(4)3;300µL5-匀，4℃6000rpm10min；500µL1000µLDNA，4℃13000rpm5µL1%琼脂糖凝胶电泳检测，剩余-20℃冷冻保存备用。绵羊总RNARNA（宝生物）330min，烘干备用。EraserSpinColumnmLgDNAEraserSpinColumn2ml70%RNASpinColumn重复步骤25℃，12000g，2min，RNASpinColumn50mLDEPC-H2O，DNA和RNA三角瓶中加入适量的核酸（100mL缓冲液约5uLGoldView），轻摇使凝胶液与混匀。品状态），10-20min，待凝3～5mm。加样品事前准备一只干净平整的PE手套，利用移液枪吸取1µL5×DNALoadingbuffer5µLDL2000LadderMarke100V15-25min首先用超纯水/RNase-ddH2O将石英比色皿润洗，用镜纸将水吸干利用TE/RNase-ddH2O校正紫外分光光度计吸取5µL待测DNA/RNA溶液，并用TE溶液/RNase-ddH2O稀释至3mL，280nm260nmODDNA/RNADNA（µg/µL）=OD260×50×稀释倍数/1000DNAOD260/OD280OD260/OD280>2.0RNAOD260/OD280≈1.8DNARTreagentKitwithgDNAEraser先在0.5mLRNase-的PCR管中加入成分：将以上组分混匀，42℃2min37℃15min，85℃5seccDNA20℃PCR参照GENEBANK中绵羊ADAMTS-1(登录号：GU437212)cDNA全列，使用Primer5.0设计引物。以β-actin(NM_ 4-1)。引物由苏州生物科技合成。4-1Table4-1primerPCRPCR离子的浓度等。PCRPCRDNA物质量的下，维持其他条件不变，仅改变其中任意一个条件，将该条件设PCRPCR25µLdd10×PCRLoadingPrimerPrimerTaqPCR4-2PCRTable4-2TheBestamplifiedreactionprogramof荧光定量RocheLightCycler480ⅡPCR个样品的目的表达量用β-actin作为内参对照定量PCR 反应程序为95°C，2 min；95°C，15 s，60°C(ADAMTS-1)/60°C(β-actin)30s，72°C，30s，40个循环;每个循环的退火以及延60s；4°C，30s。对照用0.2mLddH2O代替模版。结束后系统自动生成溶体的不同组织表达实验在同一批进行。为了保证数据的准确性每个样品进行410-1、10-2、10-310-4cDNA为模版进行荧光定量分析，选择表达最为合适(Ct值)cDNA样品为标准品。PCRPCR同第二章同第二章频率和型频表达量通过2-△△Ct计算(Zhangetal.,2014)[76]。不同组织中ADAMTS-1SPSS21.0软件进行单因素方差分析，多重比较采用Duncan’sP<0.05，所得数据以平均值±标准误(n=10)表示。绵羊ADAMTS-1的组织表达分、利用RT-PCR技术对羊单羔母羊羊双羔母羊和小尾寒羊多羔母羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、下丘脑、垂体、8个组织ADAMTS-1基(4-1)。、图4-1绵羊母羊ADAMTS-1在8种组织的RT-PCR电Figure4-1RT-PCRelectrophoresispatternofADAMTS-1genein8organsof注:1;2心脏;3肝脏;4肺脏;5脾脏;6下丘脑;7垂体;8肾Note:1ovary;2heart;3kidney;4lung;5spleen;6hypothalamus;7pituitary;8中的表达量进行定量分析，用实时荧光定量PCR法对绵羊ADAMTS-1在8组织中表达量进行分析，内参B-actin和目的ADAMTS-1溶解曲线(图4-2)，可知两个扩增产物的Tm值均一，溶解曲线上呈现明显的单峰，说明Q-PCR反应过程中，两种引物扩增特异性效果良好，没有出现非特异性扩增AB图4-2绵羊ADAMTS-1和B-actin的溶解曲Figure4-2MeltingcurveforsheepADAMTS-1geneandB-actin绵羊ADAMTS-1的表达水平，三个绵羊群体的表达量高于其他组垂体、下丘脑(图4-3)。同一组织不同绵羊表达水平分析可知，中小尾寒羊多羔母羊与羊单羔母羊、羊双羔母羊表达量差异显著(P<0.05)，羊双羔母羊和羊单羔母羊差异显著(P<0.05)，且小尾寒羊多羔的表达量是、羊双羔母羊的1.54倍羊单羔母羊的2.61倍。其余组织间差异不显著、ABFigure4-3TheexpressionlevelofADAMTS-1geneindifferentorgansofthreekindsof注:A中不同小写字母表示同一组织在不同绵羊群体下的表达量差异显著(p<0.05,N=10,mean±S.E.)B中不同大写字母表示同一绵羊群体下不同组织中的表达量差异显著(p<0.05,N=10,mean±S.E.)Note:DifferentlowercaselettersinAindicatesthattheexpressionofthesameorganwassignificantlydifferent(p<0.05,N=10,S.E.+mean)indifferentsheeppopulations;DifferentcapitallettersinBindicatesthattheexpressionlevelsofdifferentorgansinthesamesheeppopulationweresignificantlydifferent(p<0.05,N=10,mean+S.E.)绵羊ADAMTS-1第五外显子多态性分依据试验目的所设计的引物分别对绵羊血液组样品进行扩增，利用2％4)Figure4-4ThePCRdetectionofsheepADAMTS-1geneexonSSCPP1