生殖细胞培养讲课

生殖细胞培养讲课课件第1页，课件共64页，创作于2023年2月

植物生殖细胞培养

1.花药和花粉的培养；2.子房胚珠的培养；3.离体受精;4.胚的培养；5.胚乳的培养。

第2页，课件共64页，创作于2023年2月理论基础？？？？？？植物细胞的全能性：指植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。植物细胞全能性是植物组织培养的理论基础。

第3页，课件共64页，创作于2023年2月第一节花药和花粉培养总的来说，花药和花粉培养是指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精而发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整植株的技术。

第4页，课件共64页，创作于2023年2月第一节花药和花粉培养1.花药的培养方法2.影响花药诱导频率的因素3.花粉的培养方法4.单倍体育种第5页，课件共64页，创作于2023年2月花药培养的概念

花药培养(antherculture)：将发育到一定阶段的花药剥离下来(切去花丝部分)接种到培养基上进行培养，最终形成完整植株的过程。第6页，课件共64页，创作于2023年2月花药花药：花丝顶端膨大呈囊状的部分，是雄蕊的重要组成部分。每一花药通常由4个或2个花粉囊组成，左右对称分开，中间以药隔相连。花粉囊是产生花粉的地方。第7页，课件共64页，创作于2023年2月花药培养方法花药培养的基本程序是：培养材料的选择－材料(花蕾)预处理—外植体消毒灭菌—接种培养—植株再生—诱导生根—单倍体植株的染色体加倍及驯化移栽第8页，课件共64页，创作于2023年2月1.培养材料的选择

需注意以下问题：材料的基因型供体植株生长条件和生理状态花粉发育时期：单核期,尤其是单核中、晚期(单核靠边期)雄配子体的发育营养细胞生殖细胞精子第9页，课件共64页，创作于2023年2月2.材料的预处理预处理是小孢子培养成功的前提条件预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加。预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，包括低温、高温、化学物质、离心、射线等。第10页，课件共64页，创作于2023年2月3.外植体消毒4.接种5.培养6.植株再生7.生根8.驯化与移载9.单倍体植株的染色体加倍

第11页，课件共64页，创作于2023年2月操作过程注意事项避免花药受到损伤，要淘汰受伤的花药，因为损伤常常会刺激花粉壁形成二倍体的愈伤组织；花药培养一般由光照(12-18h,28℃)和黑暗(12-16h,22℃)周期交替进行。第12页，课件共64页，创作于2023年2月水稻花药培养过程旗叶鞘用70％酒精擦洗一遍剥去旗叶鞘，取出稻穗10％漂白粉10min无菌水洗3次培养5天，花药变褐，20天后花药裂开，长出淡黄色的花粉愈伤组织，先长芽，后长根，形成幼苗。用接种环接种到培养基上左手持穗，右手用镊子取花药，放无菌培养皿中第13页，课件共64页，创作于2023年2月感谢！第14页，课件共64页，创作于2023年2月影响花药诱导频率的因素

主讲人：刘晓第15页，课件共64页，创作于2023年2月一、花粉发育时期

不同物种花粉最适的发育时期不同，只有发育到某一时期的花粉对离体刺激才最敏感。因此选择合适的花粉发育时期的花药很关键，多数植物单核期的花粉培养容易成功。

第16页，课件共64页，创作于2023年2月适宜时期：单核期,尤其是单核中、晚期(单核靠边期)花粉粒的发育营养细胞生殖细胞精子第17页，课件共64页，创作于2023年2月花粉粒的形成过程造孢细胞2n四分体n有丝分裂减数分裂花粉母细胞2n单核花粉粒n成熟花粉粒n（雄配子体）3-细胞花粉粒（三核花粉粒）精细胞n精细胞n2-细胞花粉粒（二核花粉粒）营养细胞n生殖细胞n第18页，课件共64页，创作于2023年2月第19页，课件共64页，创作于2023年2月不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期发育时期物种减数分裂期草莓、番茄四分孢子期葡萄单核早中期石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯单核晚期荔枝、茄子、青椒、小麦单核早期至晚期烟草单核早期至双核期梨、水稻、甘蓝四分孢子期至双核期玉米第20页，课件共64页，创作于2023年2月一般来说,培养处于单核中期至晚期的花粉效果较好.因为处于花粉减数分裂时期的幼嫩花药和花粉充满淀粉粒的较老花药都不能产生胚状体.花粉的发育时期还影响再生植株的倍数性水平,如烟草、曼陀罗属和天仙子属用单核期花粉进行培养所得到植株是单倍体,而使用更迟时期的花粉培养获得的植株表现出不同的倍数性水平.第21页，课件共64页，创作于2023年2月与单核靠边期相对应的植株外在形态水稻：叶枕距为5-15cm,颖片淡黄绿色，雄蕊长度接近颖片长度的1/2。烟草：花蕾的花冠大约与萼片等长；芦笋：花蕾长为2-2.5mm,选取一级侧枝的花蕾较为合适，因为在一级侧枝的花蕾发育良好，数量大，发育同步。第22页，课件共64页，创作于2023年2月二、花药供体植株的生长条件

(一）供体植株的年龄一般而言，取相对年幼植株的开花始期的花药比开花末期植株上的花药更适当。在对曼陀罗、烟草和拟南芥的花药培养中均发现采自始花期的花药诱导频率较高，并随植株年龄的增长呈下降趋势。第23页，课件共64页，创作于2023年2月（二）供体植株的生理状况在适宜条件下生长而成的健康植株的花药培养和花粉培养的胚诱导率和植株再生率高从季节上看，冬春两季较夏秋两季更适合进行花药培养，这可能与温度和光周期共同的作用有关此外，对植株的物理处理以及植物激素和矿物质元素的应用也会改变植株的生理状况，从而影响花粉诱导频率第24页，课件共64页，创作于2023年2月（三）水稻、小麦、大麦等禾本科植物，主茎穗比分蘖穗花药愈伤组织的诱导率明显的提高，同步化程度高。第25页，课件共64页，创作于2023年2月三、培养基是花药培养中影响花粉启动和再分化的重要条件

培养基成分是最重要的因素之一,不仅决定着花药培养的成功,还决定着雄核发育的方式.在花药培养中,所用的培养基一般随植物种类不同而异

第26页，课件共64页，创作于2023年2月N6培养基C17、W14培养基：在N6培养基基础上进一步降低铵盐和硝酸盐浓度，同时附加生物素，可大幅度提高小麦的花药出愈率。马铃薯培养液：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15~20g,水1000mL。将马铃薯去皮切碎，煮烂后取汁，加入葡萄糖，加入琼脂，加水1000mL，121℃灭菌即可。被广泛运用于小麦花药培养。第27页，课件共64页，创作于2023年2月（一）培养基中植物生长物质的种类会影响花粉发育的途径，以及影响到花药不同倍性组织的生长或抑制。不同植物激素和生长物质对植物有不同作用一般在禾本科植物中，常用1-5mg/L2,4-D或NAA诱导花粉愈伤组织形成，再将愈伤组织转移至降低或去除生长素或补加细胞分裂素类物质的分化培养基上，以诱导器官分化和再生植株形成。茄科一些植物里，花药即使培养在不含任何生长物质的培养基上也能形成胚状体第28页，课件共64页，创作于2023年2月（二）培养基中糖的浓度和种类对花粉胚的诱导和分化有显著影响。基本培养基中的糖是不可缺少的,因为它不仅是碳源,同时还具有渗透调节的作用.通常蔗糖的水平为2%～4%,但6%～12%的高浓度也在小麦、油菜和马铃薯等植物上得到了成功的应用.一旦生长开始,高水平的蔗糖将不再产生有益的影响,胚状体唯有转移到低浓度蔗糖的培养基上才能正常分化成小植株不同的糖源对花药培养也有一定的影响。大麦、小麦、水稻等的花药培养的研究结果认为以麦芽糖代替蔗糖作为碳源可以提高愈伤组织诱导率第29页，课件共64页，创作于2023年2月（三）铁盐也影响胚状体的发育，在不含铁或铁含量低于临界浓度的培养基中，烟草花粉胚停止在球胚型阶段。（四）在培养基中加入活性炭能促进花药培养

在培养基中加入活性炭能够有效的提高烟草、银莲花、马铃薯和毛叶曼陀罗等花药的反应.活性炭的这种效应可能是因为它吸收了琼脂本身所固有的或从衰老的花药壁中释放出来的有害物质.第30页，课件共64页，创作于2023年2月

四、低温预处理可以提高花粉胚的诱导频率

以1-5℃预低温处理小麦幼穗，能提高花粉愈伤组织的产量。在4℃下冷冻石刁柏花蕾，预处理4天、8天和12天，愈伤组织诱导率比室温对照分别提高2.4倍、1.9和1.5倍。各种植物要求预处理的温度和时间不同。第31页，课件共64页，创作于2023年2月五、温度是影响花药反应的一个重要因素小麦要求先高温培养64天之后，再转入28-30℃下培养。一直高温培养效果并不好。较高的温度虽能诱导较高频率的花粉愈伤组织，但愈伤组织分化白化苗的频率也高。控制培养温度仍是减少白化苗的一个有效措施。第32页，课件共64页，创作于2023年2月感谢！第33页，课件共64页，创作于2023年2月花药培养花粉培养主讲人:张杰第34页，课件共64页，创作于2023年2月花粉培养

花粉培养(pollenculture)：又称小孢子培养，或游离小孢子培养(isolatedmicrosporeculture)，是指在无菌条件下，将花粉从花药中游离出来，使其分散或游离态，发育成单倍体植株的过程。

第35页，课件共64页，创作于2023年2月花粉：花粉囊里的花粉母细胞经减数分裂形成的小孢子。萌发时产生含三个单倍体核的雄配子体。花粉第36页，课件共64页，创作于2023年2月花粉培养的一般程序1、从植株上采取花粉单核期或双核初期的花蕾或幼穗2、在保湿条件下低温保存或预处理3、取出花蕾进行表面消毒4、花药的预培养，包括甘露醇高渗预培养和高温（35℃）预培养，预培养时间1~8d不等，取决于植物种类的不同5、在无菌条件下从花药中分离小孢子6、花粉胚或花粉愈伤组织发育到适当阶段时将其转入植株再生培养基，形成花粉植株7、花粉植株的染色体加倍（在试管苗阶段，或者移栽成活以后）8、花粉植株移入土壤栽培第37页，课件共64页，创作于2023年2月花粉培养方法取花蕾（镜检）预培养数天取花药消毒分离花粉接种培养愈伤组织发生第38页，课件共64页，创作于2023年2月花粉收集方法1、花粉分离收集：由于花粉包于花药内，必须将它们从花药中分离、收集才能进行培养。2、收集方法：

1）机械挤压法：主要有挤压法和研磨过滤收集法

①挤压法：是将花药消毒后，加入少量的分离溶液，用镊子或小玻璃棒将花粉从花药中挤压出来，通过不锈钢网或尼龙网筛去组织碎片，收集悬浮液，然后用30％蔗糖离心收取悬浮在蔗糖溶液上层的完整花粉粒，再用培养基洗涤几次后用于培养。第39页，课件共64页，创作于2023年2月

②

研磨过滤收集法：在无菌条件下，将采集到的花蕾经表面消毒后剥离出花药，再将花药置于无菌的研钵中研磨并挤出小孢子，同时滤去药壁等大的组织碎片，经离心收集后接种于适宜培养基上进行培养的方法。

2)自然散落法：将花药接种于液体培养中，使花粉自然释放，再进行收集培养。第40页，课件共64页，创作于2023年2月

3）机械游离法:主要有磁搅拌法和小型搅拌法。

①磁搅拌法：利用机械力使花药壁破裂至花粉溢出的方法。

②小型搅拌法：又称超速旋切法，是通过转轴的高速转动带动花蕾、穗子切段或花药高速运动而使之破裂，从而使小孢子游离出业，经过分级过筛收集后进行培养。第41页，课件共64页，创作于2023年2月花粉纯化：需经过筛、梯度离心、收集等步骤。梯度离心前（小孢子形态、活力不一致）30%蔗糖梯度离心后（获得均一的小孢子群体）第42页，课件共64页，创作于2023年2月5.离体条件下小孢子发育成植物体的途径

根据小孢子最初几次分裂方式的不同

小孢子(均等细胞)发育途径（途径Ⅰ）：单核小孢子有丝分裂形成2个等同的子细胞

营养细胞发育途径（途径Ⅱ）：单核小孢子进行一次正常的非均等分裂后，营养细胞继续分裂

生殖细胞发育途径（途径Ⅲ）：单核小孢子进行一次正常的非均等分裂后，生殖细胞继续分裂

生殖细胞和营养细胞(不均等细胞)发育途径（途径Ⅳ）：单核小孢子进行非均等分裂后，生殖细胞和营养细胞均继续分裂，参与孢子体的形成。第43页，课件共64页，创作于2023年2月5.离体条件下小孢子发育成植物体的途径

第44页，课件共64页，创作于2023年2月总结:花药和花粉培养基本流程：预处理花药（物理或生理逆境）收集具胚性小孢子的花药，或离心收集胚性小孢子培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体胚状体转移至固化培养基上”萌发”形成小植株。选择合适的供体植株（F1？）倍性鉴定或染色体加倍第45页，课件共64页，创作于2023年2月思考：

花药培养和花粉培养有什么不同？第46页，课件共64页，创作于2023年2月花粉培养成苗途径与花药培养比较:

相同点：胚状体成苗途径、愈伤组织再分化成苗途径不同点：花粉培养：花粉分离收集及培养方式(需进行花粉的分离特殊的花粉诱导培养)第47页，课件共64页，创作于2023年2月2.花粉培养与花药培养相比的优点：

a、花药培养容易受药壁、花丝、药隔等体细胞组织的影响，再生植株会出现不同倍性的个体，而分离的花粉培养可以克服这一不足。

b、能更好调节控制核发育的各种因子，而且可以直接从单细胞开始观察整个雄核发育的过程，为研究雄核的生理生化等问题提供方便。

c、原则上，从花粉培养能得到更多的花粉植株。第48页，课件共64页，创作于2023年2月总结异同点：相同点：二者培养的目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。不同点：花药培养属器官培养，花药是植物花的雄性器官，包括体细胞性质的药壁和药隔组织，以及雄性性细胞的花粉粒花粉培养属细胞培养；花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产量高，但技术更复杂，比花药培养难度大。第49页，课件共64页，创作于2023年2月感谢！第50页，课件共64页，创作于2023年2月单倍体育种主讲人：李莉第51页，课件共64页，创作于2023年2月单倍体植物用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株。花药培养、花粉培养；胚珠或子房培养（未受精）单倍体育种利用植物组织培养技术（如花药离体培养等）诱导产生单倍体植株，再通过某种手段使染色体组加倍（如用秋水仙素处理），从而使植物恢复正常染色体数。单倍体是具有体细胞染色体数为本物种配子染色体数的生物个体。一、概念第52页，课件共64页，创作于2023年2月原理和方法原理：染色体变异方法：花药离体培养出单倍体，然后再用秋水仙素处理幼苗或者萌发的种子第53页，课件共64页，创作于2023年2月常规育种在杂交F5、F6代开始选择；花药培养在F1或F2代进行培养，再人工加倍处理．缩短育种周期3--5年克服后代分离，大大缩短育种周期第54页，课件共64页，创作于2023年2月单倍体育种优势大大缩短了育种年限比常规杂交育种的程序简单提高变异频率大幅度改良某些性状定向改良品种第55页，课件共64页，创作于2023年2月单倍体育种的意义良好的遗传研究材料加速育种进程提高选育效率突变体选育遗传转化受体利用单倍体育种对栽培品种进行纯化第八章

生殖细胞培养第56页，课件共64页，创作于2023年2月例子：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株

常规方法：AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb与Aabb、aAbb区分开。

AB

aB

Ab

abAB AABB AaBB AABb AaBbaB aABB aaBB aABb aaBbAb AabB AabB AAbb Aabbab aAbB aabBaAbb aabb单倍体方法：AAbb出现的概率为1/4。

单倍体

二倍体

AB-------------------------->AABB

aB---------------------------->aaBB

Ab---------------------------->AAbb ab---------------------------->

aabb供体亲本AaBb花培第57页，课件共64页，创作于2023年2月思考花药离体培养与单倍体育种是一回事吗？花药离体培养得到的植株一定是单倍体吗？第八章

生殖细胞培养第58页，课件共64页，创作于2023年2月花药离体培养

花药离体培养是一种组织培养技术，其过程是：①把花粉发育到一定阶段的花药，通过无菌操作技术，接种在人工培养基上进行离体培养；②花粉在培养基所提供的特定条件下可以发生多次分裂，形成类似胚胎的构造（胚状体）或愈伤组织；③诱导愈伤组