水中大肠菌群的测定

实验三(设计性)：九龙江水大肠菌群的测定XXX(学校系别班级学号)摘要：所谓大肠菌群，是指在37°C24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称。水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。关键词：大肠肝菌群、江水、测定THEDETERMINATIONOFCOLIFORMBACTERIAINJIULONGRIVERXXX(09foodscienceinBiologyDepartment,ZhangZhouNormalUniversity091304103)Abstract:Coliformbacteria,thegenerictermsofamphimicrobian,Gram-negativeandnon-spore-bearingbacilluswhichcanfermentlactosetoproduceacidandgasat37Cin24hours.Coliformbacteriainwateristheactualnumericalvalueofescherichiacoliin100mLtestedwater,isshowedbythemostapproximatenumber(MPN)ofcoliformbacteria.Themethodofinspectionofcoliformbacteriainwater,alwaystobemultibarrelfermentationandfiltrermembrance.Themethodofmultibarrelfermentationcanuseinthetestofallkindsofwater,butitisverboseandneedsmuchtime.Themethodoffiltrermembrancejustapplicablestotapwateranddeepwellwater,itiseasyandfasttooperate,butitisnotsuitableforthewaterwhichhasmuchimpurityandiseasytoblockfiltrationpore.Keyword:coliformbacteria、waterinriver、determination水中的病原菌多数来源于病人与病畜的粪便。由于病原菌的数量少，检测过程复杂，因此，直接测它们的存在是非常困难的专业化工作。由于大肠杆菌在粪便中数量最大，在体外存活时间与肠道致病菌相近，且检验方法比较简单，因此一般采用测定大肠杆菌群或大肠杆菌的数量来作为水被粪便污染的标志。如果水中大肠杆菌的菌数超过一定的数量，则说明此水已被粪便污染，并有可能含有病原菌。我国规定每升自来水中大肠杆菌不得超过3个。检测大肠杆菌群的方法有稀释培养法和滤膜法两种，其中稀释培养法是标准分析法，为我国大多数卫生单位和水厂所使用。本课题是在实验室条件下，对九龙江水样进行大肠杆菌群数量的测定，结果报道如下。1材料与方法1.1多管发酵法1.1.1水样的采集用高温灭菌过的试剂瓶到九龙江取水，将瓶子连瓶盖一起伸到10-15厘米的深处打开瓶塞，等水满后盖上盖子后从水中取出。运送水样时应避免玻璃瓶摇动，水样溢出后又流回瓶中，从而增加污染。1.1.2水样的稀释将灭菌的三根试管各装9ml的无菌水标上1、2、3的记号。充分振荡水样，从中吸取1ml于1号试管中，充分振荡即得1：10的稀释液。同理配制1：100及1：1000稀释液。1.1.3水源水的检查（1） 初步发酵试验在1个含有50ml三倍浓缩的乳糖胆盐蛋白胨发酵烧瓶中，加入100ml水样（轻度污染水的测定）。在2支含有5ml三倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样（中、轻度污染水的测定各一支）。（2） 从原水样、1:10、1:100、的稀释液各吸取1ml于4支经过灭菌的装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨中。（每吸取一次，吸头都要换一次。）原水样，1:10重复一次（中、轻度污染水的测定各一支）。（3） 将上述溶液混匀后，于36摄氏度培养24h，24h未产气的继续培养至48h。记录其稀释液的产气管数，进行复发酵试验。（4） 平板分离经24h培养后，将产酸产气及48h产酸产气的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37°C下培养18-24h，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。（5） 复发酵试验经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖胆盐蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1-3个，37C培养24h，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表，即得大肠菌群数。表1：大肠菌群检数表（严重污染水）接种水样量/ml每升水样中大肠菌群数备注10.10.010.001————<900接种水样量为1.111（1,0.1,0.01,0.001个一份）———+900——+—900—+——950——++1800—+—+1900—++—2200+———2300—+++2800+——+9200+—-—9400

+—++18000++——23000++—+96000+++—238000++++>238000大肠菌群检数表（中度污染水）接种水样量/ml每升水样中大肠菌群数备注1010.10.01————<90接种水样量为11.11（10,1,0.1,0.01个一份）———+90——+—90—+——95——++180—+—+190—++—220+———230—+++280+——+920+——940+—++1800++——2300++—+9600+++—23800++++23800大肠菌群检数表（轻度污染水）接种水样量/ml每升水样中大肠菌群数备注1001010.1————<9接种水样量为11.11（10,1,0.1,0.01个一份）———+9——+—9—+——9.5——++18—+—+19—++—22+———23—+++28+——+92+——94+—++180++——230++—+960+++—2380++++23801.2革兰氏染色法1.2.1制片（1） 涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中间加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，制成很薄的涂面，注意取菌不要太多。（2） 晾十：让涂片在酒精灯火焰上方文火烘干。（3） 固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）注意：①要用活跃生产期的幼培养物做革兰氏染色；涂片用的载玻片要洁净无油污迹，否则影响涂片。挑菌量应少些，涂片宜薄，过厚重叠的菌体则不易观察清楚。1.2.2初染（1） 结品紫色染色：将玻片置于干净的培养皿上，加适量（以盖满细菌涂面）的结品紫染色液染色1-2分钟。（2） 水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。1.2.3媒染（1） 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1分钟。（2） 水洗：用水洗去碘液。1.2.4脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性细菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性细菌。而脱色时间过短，革兰氏阴性细菌则会被误认为是革兰氏阳性细菌。脱色时间的长短还受涂片的厚薄、脱色时玻片晃动的程度等因素的影响。脱色时间一般约20-30S。1.2.5复染（1） 用番红复染约2分钟。（2） 水洗：用水洗去涂片上的番红染色液。（3） 晾十：将染好的涂片用吸水纸吸干。1.2.6镜检镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反

应性。被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏阴性菌。1.3试剂与仪器乳糖胆盐蛋白胨，伊红美蓝琼脂（简称EMB，37.5克，溶于1000mL蒸馏水），灭菌水，大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物，蜡样芽孢杆菌（B.cereus）12〜24h营养琼脂斜面培养物，革兰氏染色液。试管、吸头（1ml、5ml）、冰箱、量筒、玻棒、烧杯、PH计、培养皿、水浴锅（箱）、培养箱、试剂瓶、电磁炉、显微镜、锥形瓶、接种环、干燥箱、汉德氏管、高压灭菌器、单道移液器、电子分析天平、SW-CJ-2FD超净工作台，LDZX-40B1不锈钢立式灭菌消毒器、天平、M-50砂芯过滤器、真空泵、0.45〃m的滤膜、镊子、显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶（内装香柏油和二甲苯结，果与纸、析理盐水等。3总结与讨论经过实验结果与国家标准比较后，可得出九龙江水质基本符合国家标准。测量一个江水，特别像九龙江这么大一条江，应该在江的不同点采样，多处采样，多次测定才能比较准确地测定江水水质指标，但是由于实验条件有限，所以这次只能取一个点来测量，由此测量结果未必准确，但可以大概地反映江水的水质。本次实验中，并不是所有培养基的试管都出现产酸产气，可能原因有以下几方面:水样浓度太低采集水样时没有用专门的水样瓶，而是用锥形瓶代替水样瓶由于实验条件的限制，没有完全按标准发去做，平行试验太少原水样与10-1浓度培养后均表明有大肠杆菌存在，即本次实验还是比较成功的。在镜检中，均发现了阳性菌及阴性菌存在，说明大家对革兰氏染色掌握比较好。讨论：由于人们生活水平的提高，越来越多的河水、湖水遭受到不同程度的污染，很多河湖水的综合污染指数逐年呈上升趋势，这就给环境工作者带来了巨大挑战，如何治理，如何控制，最主要的是从源头治理，而不是仅仅从末端治理。而近年来人们最担心的是江水的富营养化，但是水中的大肠杆菌群数始终是一个显著的污染指标。除了大肠杆菌外，我们还应该注意湖水的其他水质指标，比如水中重金属的含量，还有水的色、嗅、味等指标。而其中湖水中的含C、N、P比例失调也将会引起很大的污染。本次实验数据与结果只是作为实验测定而用，由于实验条件等个方面的原因，这次报告并不能完全代表九龙江实际江水的水质指标，其实际指标还