第9章电泳和电色谱课件

第九章电泳技术1

1.基础理论1.1定义——带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳(electrophoresis，简称EP)

电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的扩散双电层，离子尺寸越大、溶液中的离子强度越高时，电泳现象变得越明显。因此，电泳现象中的表面电势和双电层的因素起着决定性的作用。图1电泳过程示意图

A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。

2

电泳现象早在1808年就已经被发现，但电泳作为一种分离技术却是在1937年由瑞典科学家Tiselius首先提出来的，并设计出世界上第一台自由电泳仪，建立了“移界电泳”分离模式。他用光学方法观察到在电泳迁移过程中血清蛋白质界面的移动，首先证明了血清是由白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白组成的，为表彰他对电泳技术所做出的突出贡献，1948年他被授予诺贝尔奖。1.2电泳技术的发展过程320世纪50年代，以支持介质为主的电泳模式不断涌现，如滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉薄膜等。60年代以后发展了以凝胶为主的支持物的电泳方法，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶电泳等。1967年在凝胶电泳的基础上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。70年代以后根据不同需要推出了多种电泳模式，如圆盘电泳、垂直板电泳、双向电泳、脉冲电泳、等电聚焦电泳、印迹转移电泳等技术90年代又推出了分辨率极高的高效毛细管电泳。多年来科学家们对电泳结果的分析做了大量的工作，建立了各种实验方法，电泳后对分离物质可以用染色、扫描、紫外吸收、放射自显影、生物活性测定等方法进行分析，得到所需数据。4(1)电泳迁移(electrophoreticmigration)：

在电泳过程中，带电粒子在电场的作用下做定向移动，单位是cm(2)迁移时间(migrationtime)：用tm表示

在电泳过程中，带电粒子在电场的作用下做定向移动所用的时间，单位是min。(3)电泳速度(electrophoreticvelocity)：用Vep表示

在单位时间内，带电粒子在电场的作用下做定向运动的距离，单位是cm/sec1.3电泳的常用术语5(4)电场强度(electricfieldstrength)：用E表示在给定的电泳支持物两端电极施加电压后所形成的电效应，单位是V/cmE=V/Lt式中V为电压，Lt为两端电极的距离。(5)电渗流(electroosmoticflow)：用EOF表示在电场中电泳溶液的正电荷与固体支持物表面上的负电荷之间相互作用，形成一个正离子层，导致流体朝负极方向移动，称为电渗流，这种现象也称之为电渗(electroosmosis)现象。AB6(6)相对迁移率(relativemobility)：用mR表示蛋白质样品的迁移距离与示踪染料的迁移距离之比即为相对迁移率，即蛋白质的迁移距离(cm)mR=—————————————示踪染料的迁移距离(cm)71.4电泳的基本原理（1）带电颗粒溶液中任何物质由于其本身的解离或表面吸附其它带电质点而带电，在电场中就会发生迁移，移动方向取决于它们的带电符号。NaCl→Na++Cl–生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于溶液中的H+浓度8（2）电泳迁移率(mobility)荷电溶质在电场中所受的静电引力f与溶质的荷电荷数Z和电场强度E成正比

f=EZe(1)带电颗粒在迁移中同时受到来自于介质的摩擦力，对于球形颗粒来说，在自由溶液中此阻力服从Stock定律：=6πrηve(2)ve是在介质粘度为η的溶液中，半径为r的带电颗粒的移动速度。但在凝胶中，这种阻力并不完全符合Stocks定律。还取决于介质中的其它因素如凝胶厚度、颗粒大小和介质的内渗等。当f=

时，荷电溶质恒速泳动,ve=E

=u0E其中u0=为电解质溶质的迁移率92分类方法种类分离原理区带电泳移界电泳稳态电泳（等速电泳、等电聚焦电泳）支持介质纸电泳

醋酸纤维薄膜电泳

琼脂凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳介质形状薄层电泳

板电泳柱电泳10(1)区带电泳(zoneelectrophoresis，ZEP)：是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后在介质上加电场，带电颗粒在支持介质上或支持介质内迁移，在电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带(图a)，这是当前应用最广泛的电泳技术。(2)移界电泳(movingboundaryelectrophoresis，MBEP)：是把电场加在生物大分子溶液和缓冲溶液之间的界面上，带电颗粒的移动速度通过光学方法观察界面的移动来测定(图b)。(3)稳态电泳(steadystateelectrophoresis)：带电颗粒在电场作用下电迁移一定时间后达到一个稳定状态，此后，电泳条带的宽度不随时间的变化而变化，如等速电泳(isotachophoresis，ITP)、等电聚焦电泳(isoelectricfocusing，IEF)(图c、d)。abcda区带电泳b移界电泳c等速电泳d等电聚焦112.1凝胶电泳作为电泳支持介质必须具有：化学惰性、不干扰大分子的电泳过程，化学稳定性好、均匀、重复性好、电内渗小等特性。分为：连续洗脱（柱式）和不连续凝胶电泳凝胶电泳的支持介质：聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel,PGA） 由丙烯酰胺和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的作用下，聚合而成；琼脂糖凝胶： 从琼脂中精制分离出的胶状多糖，其分子结构大部分是由1,3连接的β-D吡喃半乳糖和1,4连接的3,6脱水α-D吡喃半乳糖交替形成的；12柱式凝胶电泳原理：当溶质泳动到凝胶末端时，通入洗脱液分别回收各个组分。这种方法不仅操作简便，凝胶还可重复使用。缺点：回收的溶质浓度很低。柱式凝胶电泳示意图13不连续凝胶电泳由浓度不同的两层凝胶组成，上层凝胶浓度低，对溶质无阻滞作用，溶质在此层得到浓缩；下层凝胶浓度高，各组分根据在凝胶中迁移率的差别得到分离。1415聚丙烯酰胺电泳（PAGE）16琼脂糖凝胶的性能、结构与特点其优点如下：琼脂糖凝胶孔径较大，0.075%琼脂糖的孔径为800nm，可以分析百万道尔顿分子量的大分子，但分辨率较低。机械强度高：可以在浓度1%以下使用；无毒；染色、脱色程序简单，背景色较低；热可逆性；生物中性：一般不与生物材料结合；电内渗（EEO）大：对于对流电泳有益琼脂糖凝胶的特性：

琼脂糖(agarose)是从琼脂中精制出来的胶状多糖(gel-formingpolysaccharide)，琼脂又是从天然的红色的墨角藻(red-seaweed)中提取出来的。172.2载体两性电解质pH梯度等电聚焦等电聚焦（isoelectrofocusing）,IEF 利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。利用等电聚焦技术分离、分析的对象仅限于蛋白质和两性分子。根据建立pH梯度的原理不同，梯度有分为载体两性电解质梯度（CarrierampholytespHgradient）和固相梯度。18工作原理蛋白质的等电点 蛋白质最主要的特性是它的带电行为，它们在不同的pH环境中带不同数量的正电或负电，只是在某一pH时，蛋白质的净电荷为0，此pH即为该蛋白的等电点（isoelectricpointpI）。蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象，是一个物理化学常数。可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析载体两性电解质pH梯度等电聚焦是在支持介质中加入载体两性电解质，通以直流电后在两极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，当带电的蛋白质分子进入该体系时，便会产生移动，并聚集于相当于其等电点的位置。等电聚焦分离示意图19等电聚焦示意图20载体两性电解质在电场中形成pH梯度的模式图在没有电场时，载体两性电解质的pH值大约是该溶液pH范围的平均值，所有载体两性电解质分子都带有荷电。当引入电场时，载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子（荷最多负电）将最快地向阳极移动；当它达到净电荷为0的位置时才停止，这个位置靠近阳极，由于它具有高的缓冲能力，使环境溶液的pH等于分子本身的pI。其次，一些低pI的载体两性电解质（荷其次多的负电）也向阳极移动，直到它的净电荷减少到0才停止。同样的，其周围环境溶液pH值也等于它本身的pI。依次类推，所有的载体两性电解质分子用增加pI级数的方法将分别在阳极、阴极之间到达它们自己的位置，从而给出一个pH梯度。21IEF特点受溶质扩散影响小，IEF可消除分子扩散引起的分离度下降。两性电解质的加入对产品产生污染；pH梯度稳定性不高；操作过程中易发生凝胶脱水起皱现象；222.3二维电泳第一相等电聚焦第二相SDS－PAGE目的：为了获得更详细的组分信息目前已经广泛应用于蛋白质组研究中23二维电泳原理在凝胶电泳槽的y方向上具有浓度分布，而在x方向上首先调配pH值梯度，使溶质分子以等电点聚焦的形式泳动到其等电点处。然后将适当pH值的缓冲液渗透到凝胶中，在y方向上加电场使溶质再次泳动。此时溶质之间的泳动速度受荷电量及分子量的影响，直至泳动到被高浓度凝胶所阻滞，相互之间得到进一步分离。二维电泳＝凝胶电泳＋等电点聚焦242526二维电泳特点分离度高，可分离等电点相差0.01个pH值的蛋白质；处理量小，适用于分离微量的高纯度目标产物，用于科学研究；27凝胶电泳系统主要包括电泳仪电泳槽附属设备3电泳系统28(1)常压电泳仪(600V)：主要用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；(2)高压电泳仪(3000V)：用于载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序；(3)超高压电泳仪(30000-50000V)：用于毛细管电泳。3.1电泳仪根据电泳仪的电压设计范围可将其分为三类：29(1)自由界面电泳槽Tiselius设计的自由界面电泳槽是一个U形玻璃管，在U形管下部放待分离的蛋白溶液，管臂联接到电极上，在电场的作用下，缓冲系统中蛋白质界面的移动可用光学法照相，得到电泳图谱。这种电泳槽目前已不使用。3.2电泳槽电泳槽主要有自由界面电泳槽、管状电泳槽、板式电泳槽。电极电极U形管Tiselius自由界面电泳装置示意图30(2)圆盘电泳50年代末商品圆盘电泳槽问世。圆盘电泳槽有上下两个电泳槽和带有铂金电极的盖，电泳槽具有若干个孔，可插电泳管。将丙烯酰胺凝胶贮液装在玻璃管内，凝胶在电泳管中聚合成柱状胶条，样品经电泳分离，蛋白区带染色后呈圆盘状，因而称圆盘电泳(discelectrophoresis)。圆盘电泳

聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图

(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7

(2)浓缩胶pH6.7

(3)分离胶pH8.9

(4)电极缓冲液pH8.331(3)板状电泳槽板状电泳槽是目前使用最多的电泳槽，是将凝胶灌装在两块平行的玻璃板中间，因而称板状电泳(slabelectrophoresis)。板状电泳的最大优点是包括标准相对分子质量蛋白在内的多个样品可在同一块凝胶上在相同的条件下进行电泳，便于利用各种鉴定方法，直接比较各样品的区带，保证结果的准确可靠；还可进行双向电泳。另外，板胶电泳时产生的热量容易消散，凝胶电泳结果便于照相和制成干胶。板状电泳槽有垂直板电泳槽和水平板电泳槽。垂板电泳槽图2

夹心垂直板电泳槽示意图

图3

凝胶模示意图

1.样品槽模板

2.长玻璃板1.导线接头2.下贮槽

3.凹形橡胶框

4.样品槽模板

5.固定螺丝6.上贮槽

7.冷凝系统

32平板电泳槽双向电泳槽适用于将凝胶电泳的图谱转移到固相转移膜上33随着电泳技术的发展，电泳技术的种类逐渐增加，凝胶电泳在制胶、电泳系统的冷却、凝胶染色及结果分析等方面手段日趋完善，科学家们研制出各种电泳附属设备，如梯度混合仪、外循环恒温系统、脱色仪、凝胶干燥系统、凝胶扫描仪、凝胶成像仪等。3.3附属设备用于对各种凝胶和放射自显影胶片、印记杂交片的分析

凝胶成像分析系统

34毛细管电泳仪35目前最常用的电泳操作模式是区带电泳中的聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳，前者主要用于蛋白质的分离鉴定，后者主要于核酸的分析鉴定。电泳的操作模式有按操作方式和分离原理分类。4电泳的操作模式36电泳流程制胶：溶液配制（丙烯酰胺、N，N’-甲叉双丙烯酰胺、载体两性电解质等），灌胶；电泳：加样可在凝胶上的任何位置，浓度一般为0.5~2mg/ml；固定：染色：脱色：37习题电泳的概念电泳技术的分类常用的凝胶电泳技术有哪些？电泳装置的基本组成聚丙稀酰胺凝胶电泳的一般过程SDS电泳的基本原理及过程琼脂糖电泳的特点及其应用等电聚焦及其特点38

例子：血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳目的：1.掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义2.熟悉电泳仪器的使用和操作原理：

血清蛋白在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，分子大小、形状各有差异。在电场作用下，可在醋酸纤维膜上分离成。A、α1、α2、β、γ五条区带。电泳结束后，将醋酸纤维膜置于染色液。使蛋白固定并染色，再脱色（洗去多余染料）。将染色后的区带分别剪开，将其溶与碱液，进行比色测定，计算各区带的百分数。39实验操作步骤及注意点1、准备与点样

1）将已充分浸透的醋酸纤维膜取出，用滤纸吸去多余的缓冲液。在膜的无光泽面距一端2cm处点样（膜不能折；在膜上标记记号）。

2）用点样器蘸血清少