沙门氏菌检测操作规程

2012-XX-XX定稿GB4789.4—2010食品微生物学检验沙门氏菌检验■ CHIATAICONTI编制人 审核人 批准人沙门氏菌检测操作规程1原理沙门氏菌的检测需要四个连续的阶段见下图：1.1用非选择性液体培养基预增菌将试料接种到缓冲蛋白胨水（BPW），在36°C±1°C下培养16〜20h。（样品中可能存在少量的沙门氏菌却含大量的肠杆菌科的其他菌，所以选择性增菌是必须的；为了检测受伤的沙门氏菌，常须进行预增菌。）1.2在选择性液体培养基上增菌由痴2012-XX-XX定稿GB4789.4—2010食品微生物学检验沙门氏菌检验rKwCHIATAICONTI编制人审核人批准人将1.1中的培养物接种到四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液和亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液中。于TTB增菌液内42°C±1°C培养18h〜24h；SC增菌液内36°C±1°C培养18h〜24h。1.3初步筛选将1.2的培养物接种到以下两个选择性培养基：亚硫酸铋（BS）琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂，于36°C±1°C分别培养40h〜48h（BS琼脂平板）或18h〜24h（XLD琼脂平板），根据菌落特性，辨别可疑沙门氏菌菌落。1.4再次筛选挑出1.3中的可疑沙门氏菌菌落，在沙门氏菌显色培养基中培养再次筛选，再用合适的生化和血清学试剂进行鉴定。2试剂与仪器2.1所用器具三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000mL枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针2.2仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅2.3所用试剂和培养基2.3.1缓冲蛋白胨水培养基（BPW）称取BPW培养基20.1g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，以90mL/瓶分装到各锥形瓶，并于121C灭菌15min，冷全常温。2.3.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液取TTB增菌液基础93.6g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装于锥形瓶中，每瓶100mL。将锥形瓶放入灭菌锅中，121C灭菌20min；冷至30C，每100mL基础培养基中加入TTB配套试剂碘液和煌绿各一支（开启前用75%酒精棉消毒西林瓶表面），混合均匀。2.3.3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液取SC培养基23g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装锥形瓶，冷至常温备用。2.3.4亚硫酸铋（BS）琼脂称取BS基础培养基39.3g，加入蒸馏水950mL，搅拌加热煮沸至完全溶解。称取亚硫酸铋指示剂8&，加入蒸馏水50mL，隔水加热至50C左右溶解。在无菌环境中，将5mL亚硫酸铋指示剂溶液加入已冷至50C左右的95mLBS基础培养4金正大康地■，肩♦CHIATAICONTI2012-XX-XX定稿GB4789.4—2010食品微生物学检验沙门氏菌检验编制人审核人批准人基中，混合均匀，倾注平板，备用。（为验证培养基无菌，可将空白平板在烘箱中培养24h）2.3.5木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂称取XLD培养基56.93g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，待冷至50°C倾注平板，备用。（为验证培养基无菌，可将空白平板在烘箱中培养24h）2.3.6沙门氏菌属显色培养基、三糖铁琼脂培养基（TSI）、蛋白胨水、靛基质试剂、尿素琼脂（pH7.2）、氤化钾（KCN）培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、糖发酵管、邻硝基酚8D半乳糖苷（ONPG）培养基3、操作步骤3.1配制BPW培养基（第一天）3.2培养基冷却全室温后，对培养基和整个房间进行紫外灭菌15分钟，关灯60min后使用。（第一天）3.3预增菌（第一天）称量样品10g至含BPW培养基的锥形瓶，并及时盖上盖子，150rpm下振荡10min，于36C±1C培养18h左右。3.4配制TTB和SC增菌液（第一天）3.5增菌（第二天）3.5.1接种和培养轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB增菌液内，于42C±1C培养18h〜24h。同时，另取1mL，转种于10mLSC增菌液内，于36C±1C培养18h〜24h。3.5.2培养现象菌名菌号生长状况TTB培养特征SC培养特征伤寒沙门氏菌CMCC（B）50071良好静置后浑浊变红，混浊鼠伤寒沙门氏菌CMCC（B）50115良好静置后浑浊变红，混浊大肠埃希氏菌ATCC25922不生长静置后清亮不变3.6配制BS和XLD琼脂平板（第二天）3.7分离培养（第三天）分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板。于36C±1C分别培养40h〜48h（BS琼脂平板）或18h〜24h（XLD琼脂平板），观察各平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表1。表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

选择性琼脂平板沙门氏菌BS琼脂菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。HE琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。XLD琼脂菌落黑心，培养基变黄色或不变色。沙门氏菌属显色培养基按照显色培养基的说明进行判定。4籍正4籍正大康地FHrchiataicontf2012-XX-XX定稿GB4789.4—2010食品微生物学检验沙门氏菌检验编制人审核人批准人3.8再分离（第四天）对于在BS和XLD平板上的疑似菌落，可以接种全沙门氏菌显色培养基上进行再鉴定。如果还是疑似菌落，则进行生化试验。3.9生化试验（生化试验管可以直接购买）3.9.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36°C±1°C培养18h〜24h，必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。表2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂赖氨酸脱羧酶实验培养基初步判断斜面底层产气硫化氢KA+(-)+(-)+可疑沙门氏菌属KA+(-)+(-)—可疑沙门氏菌属AA+(-)+(-)+可疑沙门氏菌属AA+/-+/-—非沙门氏菌KK+/-+/-+/-非沙门氏菌注：K：产碱，A：产酸；+：阳性，一：阴性；+（一）:多数阳性，少数阴性；+/一:阳性或阴性。3.9.2接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氤化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36C±1C培养18h〜24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存于2C〜5。。或室温至少保留24h，以备必要时复查。表3沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢（h2s）靛基质pH7.2尿素氤化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶A1+一———+A2++——+4金正大康地■ CHIATAICONTL2012-XX-XX定稿GB4789.4—2010食品微生物学检验沙门氏菌检验编制人审核人批准人A3————+/一注：+阳性；一阴性；+/一阳性或阴性。3.9.3反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。表4沙门氏菌属生化反应初步鉴别表pH7.2尿素氤化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶判定结果———甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）—++沙门氏菌W或V（要求符合本群生化特性）+—+沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）注：+表示阳性；+表示阴性。3.9.4反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基