色层分离法课件

第六章色层别离法6.1概述6.2柱层析6.3纸层析6.4薄层层析色层别离法又称层析法或色谱别离法，它的最大特点是别离效率高，能把各种性质及相近的物质彼此别离。现代的色谱别离技术就是在此根底上开展而来的。色层别离最早是由波兰植物学家M•茨维特提出来的。他在叶绿素的石油醚溶液流经装有碳酸钙的管柱时，发现碳酸钙对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，于是在管柱中出现了不同颜色的色谱带，因此称这种别离方法为色层别离法或色谱别离法。6.1概述层析法的开展史年代发明者发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念1931Kuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。1938TaylorUray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941Martin,Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1952Martin,James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。1956VanDeemter提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。1981Jorgenson创立了毛细管电泳法。层析别离图示“层析的本质是使一种液体均匀地渗过一个相当细碎的物质的柱体，这些物质通过某种过程有选择地阻留了液体内的某些组分。〞——马丁〔A.J.P.Martin〕〔英〕一、层析法的条件层析法应具备的因素或条件是：1.具有两相固定相——固定不动的一相流动相——即携带样品流过固定相的流动体。2.混合物中各组分的物理化学性质有差异3.屡次展开6.1概述二、层析法的分类⑴根据层析机理不同的划分凝胶层析法

——分配层析法

——离子交换层析

——吸附层析法

——吸附剂为固定相，利用吸附能力强弱的差异来分离利用组分在固定相和流动相间分配系数的差异来分离离子交换剂作固定相，利用离子交换亲和力的差异来分离凝胶作固定相，利用对分子大小的筛分作用来分离⑵根据操作技术的划分低压层析技术中压层析技术高压层析技术电泳法——操作压力在0.5MPa-5MPa之间——操作压力在5Mpa-40MPa之间——操作压力小于0.5MPa——靠溶质分子在电场中的移动速度不同而分离二、层析法的分类⑶根据固定相的状态划分：

柱层析法——固定相装填在金属或玻璃管中纸层析法——以滤纸为固定相进行层析薄层层析法——把吸附剂粉末铺成薄层作为固定相二、层析法的分类⑷根据流动相的物态不同的分类

气相层析法液相层析法气-液层析法气-固层析法液-液层析法液-固层析法二、层析法的分类各种层析法的机理及优缺点

类型机理优点缺点适用范围吸附层析化学、物理吸附操作简便易受离子干扰各种生物大分子的分离、脱色和去热源凝胶层析分子筛的排阻效应分辨力高，不会引起变性各种凝胶介质昂贵，处理量有限制分子量有明显差别的可溶性生物大分子分配层析溶质在固定相和流动相中分配系数的差异分辨力高，重复性较好，能分离微量物质影响因子多，上样量太小用于各种生物大分子的分析鉴定亲和色谱亲和色谱生物大分子与配体之间有特殊亲和力分辨力很高一种配体只能用于一种生物大分子，局限性大各种生物大分子聚焦色谱等电点和离子交换作用分辨力高进口试剂昂贵蛋白质和酶6.2柱层析一、吸附柱层析二、分配柱层析柱层析别离的原理示意图柱层析别离的根本原理示意图t1t0t1t2t0t0t3t1t2t0分子量：>>一、吸附柱层析1.原理吸附柱层析是利用吸附剂对混合试样各组分的吸附力不同而使各组分别离。

6.2柱层析一、吸附柱层析吸附剂一般是多孔性的微粒状物质，在其外表具有许多吸附中心〔或称吸附位置〕，吸附中心的数量多少以及吸附能力强弱直接影响其吸附性能。当流动相载着溶质A缓缓流过层析柱时，溶质A在固定相和流动相中不断的进行吸附、脱附、再吸附、再脱附的过程。6.2柱层析1、分配系数在一定的温度下，溶质在固定相和流动相之间的平衡关系服从分配定律：

KD=Cs/CmKD——为分配系数Cm，Cs分别为流动相和固定相中的溶质A的浓度。应用条件：温度一定低浓度一、吸附柱层析试样中各组分的分配系数有差异，分配系数大的组分，在柱中被吸附得较牢，在固定相中保存的时间较长，不易被洗脱下来，而分配系数小的组分被吸附得较不牢，在柱中保存时间较短，易被洗脱下来。洗脱时，吸附力较强的组分，移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，先出柱。一、吸附柱层析2、吸附等温线吸附等温线：某种组分在吸附剂外表的吸附规律。包括：线形和非线性。〔1〕线性吸附等温线Cm：溶质A在流动相中的浓度Cs：溶质A在固定相中的浓度当溶质A在随流动相缓慢流过层析柱的固定相时，在两相中不断吸附、脱附到达平衡CmCs〔吸附平衡〕KD=Cs/Cm

Cs固定相Cm流动相洗脱曲线假设测定流出液中A的浓度，绘制C～V的曲线，那么得到洗脱曲线〔又叫洗提曲线〕。为一对称的层析图谱。CV〔2〕非线性吸附等温线吸附剂外表具有吸附能力不同的吸附中心，溶质在其上的分配系数是不同的。吸附能力强的吸附中心，溶质在其上的分配系数KD较大，溶质分子将首先占据它们，其次再占据较弱的、弱的和最弱的吸附中心。随着溶质在吸附中心上的浓度增加，强吸附中心逐渐被饱和，其分配系数也渐变小。因此吸附等温线逐渐向下弯曲形成凸形。洗脱时，由于数量较多的弱的和较弱的吸附中心上的溶质先被洗下，因而溶质集中的区域前进较快，接着较少的强吸附中心的溶质后被洗下流出，出现拖尾峰。

Cs固定相Cm流动相Langmuir等温线（凸形）Cs固定相Cm流动相反Langmuir等温线（凹形）

3.吸附剂的选择⑴吸附剂应具有适宜的吸附力。⑵颗粒均匀、大小适宜。⑶吸附与解吸可逆。⑷不含杂质。⑸不溶于所使用的溶剂〔即洗脱剂〕，与欲别离的物质不发生化学反响。常用吸附柱介质无机物吸附介质包括：氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙(凝胶型和晶型)、氧化钛和氢氧化锌凝胶等。聚合物吸附介质有：琼脂糖、葡聚糖、纤维素和聚丙烯酰胺等〔1〕Al2O3〔中性、酸性、碱性〕I〕Al2O3分类中性：适用于醛，酮，醌，酯，内酯及苷的别离酸性：酸性化合物如酸性色素，氨基酸等碱性：生物碱，醇及其它中性和碱性物质一般地，能用酸性或碱性Al2O3别离的也能用中性Al2O3别离II〕Al2O3的活性活度级I～Ⅴ级增强吸附能力I～Ⅴ减弱在不同的温度下活化氧化铝：加热至100～150℃活化有一定活性﹥150℃Ⅱ～III级300～400℃IV～VI﹥600℃脱水开始烧结每一批Al2O3外表积和外表孔结构不一致，活性不同一般，别离极性较强的组分用活性弱的吸附剂；别离弱极性的组分用活性强的吸附剂。〔2〕硅胶弹性多聚硅酸脱水制的硅氧烷不具吸附性外表孔穴较小的硅酸吸附能较强用途：微酸性，吸附能力较Al2O3弱，可别离酸性和中性物质，如有机酸，氨基酸，萜类，甾〔胆固醇及激素属于甾类化合物〕类弹性多聚硅酸脱水OH…OH︱︱︱︱︱—Si—O—Si——Si—OH—Si——Si—︳︱︱︳︱硅氧烷游离型硅酸醛束缚型活泼型硅酸醛硅酸醛

abcd〔3〕聚酰胺乙内酰胺聚合：聚己内酰胺，锦纶可与酚类，酸类，醌类，硝类化合物形成氢键而别离。形成氢键基团的吸附能力大对、间位形成氢键﹥邻位〔空间位阻〕芳香族由于共轭吸附能力大由海洋生物琼脂提取得到的主要成分①中性不带电②水溶性线状多糖③高亲水性，含大量羟基④能制成多孔性凝胶，别离大分子制备：①去除带电琼胶成分②将溶化的琼脂糖采用悬浮,乳化或喷珠的方法制得珠状介质。③采用交联剂增加介质的机械强度〔4〕琼脂糖〔5〕葡聚糖α-1,6相连的葡萄糖聚合物，由环氧氯丙烷交联得到珠粒。性质：〔1〕亲水性比琼脂糖高〔羟基数多〕〔2〕化学稳定性及热稳定性好〔3〕孔度与机械强度与交联度有关〔4〕用于凝胶过滤分子筛应用：水溶液中别离蛋白质等〔6〕纤维素β-1,4相连的D-葡萄糖〔偶而有1，6键合〕线性天然高聚物。〔1〕亲水〔2〕微晶与无定型两局部组成，缺乏孔度大孔珠状纤维素〔1〕高孔度〔2〕高机械强度〔3)亲水性强应用：离子交换别离蛋白质介质性质：〔1〕丙烯酰胺与交联剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺共聚。〔2〕烷烃骨架与酰胺侧链〔3〕控制交联剂比例可控制网格孔度〔4〕亲水好，但不如多糖介质(5)机械强度差应用：〔1〕凝胶过滤〔2〕电泳介质〔7〕聚丙烯酰胺4、流动相及其选择(1)流动相洗脱过程的实质：流动相分子与被别离的溶质分子竞争占据吸附剂外表活性中心的过程。强极性组分选强极性的流动性洗脱，反之相反。(2)功能团极性：有机分子根本母核相同时，取代基极性增强，整个分子极性增强；极性基团增多，整个分子极性增强。分子中双键多，吸附力强；共轭双键多，吸附力强。分子形成内氢键，吸附力弱于不能形成内氢键的化合物。烷烃〔—CH3，—CH2—〕﹤烯烃〔—CH=CH—〕﹤醚类〔—OCH3，—OCH2—〕﹤硝基化合物〔—NO2〕﹤二甲胺﹤酯类〔—COOR〕﹤酮类〔C=O〕﹤醛类〔—CHO〕﹤硫醇〔—SH〕﹤胺类〔—NH2〕﹤酰胺﹤醇类〔—OH〕﹤酚类〔Ar—OH〕﹤羧酸类〔—COOH〕〔3〕常用流动相极性：石油醚﹤环己烷﹤二硫化碳﹤CCl4﹤三氯乙烯﹤苯﹤甲苯﹤二氯甲烷﹤氯仿﹤乙醚﹤乙酸乙酯﹤乙酸甲酯﹤丙酮﹤正丙醇﹤乙醇﹤甲醇﹤吡啶﹤酸在某些情况下可用混合流动相聚酰胺柱层析可采用水溶液：乙醇水溶液，丙酮水溶液等溶解试样用的溶剂极性应与流动相相近5.洗脱方法及流出曲线⑴有色物质别离的洗脱方法推出法：有色物质别离后，将吸附剂从柱中推出，用刀按层切开，分层洗脱再定量。⑵无色物质别离的洗脱方法及流出曲线无色物质分层后，可采用流出曲线加以判断。流出曲线：以物质浓度为纵座标，以收集的洗脱液体积为横座标，得出的曲线。柱层析的洗脱方法

洗脱一般有三种方法：①恒定洗脱法：②逐次洗脱法：③梯度洗脱法：梯度洗脱法是目前最常用的洗脱法。恒定洗脱分步洗脱梯度洗脱洗脱剂的选择⑴样品在溶剂中具有一定溶解度。⑵一般采用无水溶剂，且与水不互溶。⑶溶剂沸点适宜。⑷纯度要高，无杂质。二、分配柱层析分配柱层析是根据欲别离组分在两种互不混溶或局部混溶的溶剂间的溶解度差异来实现别离的。这两种互不混溶的溶剂一个是流动相，另一个被吸收在载体中，被称为固定相。流动相载着试样中的各种组分沿着层析柱流动时，试样中的各种组分就在流动相和固定相间进行分配，当不同组分的分配系数有差异时，它们在层析柱中的前进速度就不相同，于是得以别离。

二、分配柱层析1.原理分配层析是根据混合物中各组分在两种不相混溶的溶剂间溶解度〔即分配系数〕的不同，使各组分得以别离。分配系数K：当溶质在两种不相混溶的溶剂中到达平衡时，溶质在两种溶剂〔即两相〕中的浓度比值为一常数，称分配系数。

各种组分具有各自的分配系数K，同一物质，温度不同时，K不同。在分配的各组分中，某组分K↗，那么固定相中浓度↗，K↘，后出柱。2.固定相与流动相⑴固定相：由载体和一种溶剂〔多为水〕组成。⑵流动相：一般是与水互不相溶的有机溶剂。

当流动相是水或水溶液，固定相液体是有机溶剂时，称为反相分配层析。分配柱层析常用的载体有：硅胶、纤维素、硅藻土等；常用的固定相有：水、稀硫酸、甲醇、甲酰胺等强极性溶剂。流动相一般是与水互不相溶的有机溶剂，如正丁醇、正戊醇等。分配柱色谱常用来别离极性极强的、亲水性的物质，如脂肪酸、多元醇、水溶性氨基酸等。3.移动速率 主要是用于比较各组分移动速度的大小，即在同一时间内，各组分移动距离的大小，作为定性之用。

==6.3纸层析特点：微量操作技术，简便、别离效率高，但别离速度慢。纸层析(Paperchromatography)——是在滤纸上进行的色谱分析法。一、定义将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、定性和定量的液-液分配层析法。纸层析和萃取一样，也是根据不同物质在两相间的分配比不同而进行别离的〔相当于逆流萃取〕。6.3纸层析6.3纸层析二、根本原理固定相——滤纸是一种惰性载体，滤纸纤维素中吸附着的水或其它溶剂作固定相。流动相〔展开剂〕：沿着滤纸流动的溶剂(一般为有机溶剂)。试液点在滤纸上，在层析过程中，试液中各组分，因其在两相中的溶解度不同，(也就是分配系数KD不同)，因而得到别离。其原理与萃取相似。它是一种分配层析。溶质在固定相与展开剂之间反复分配。在固定相中分配系数大而在展开剂中分配系数小的，在纸条上移动速度慢，停留在纸条的靠近原点端。1.层析缸2.滤纸3.原点4.展开剂5.前沿6.7.斑点123456736.3纸层析1.纸色谱的根本原理xyRf的计算2.比移值Rf组份别离后,它们在滤纸上的位置用比移值Rf表示。[定义]:6.3纸层析比移值Rf的大小取决于各组分在二相间的分配系数及滤纸的性质。不同的组分具有不同的分配系数,因而也就有不同的Rf。这就是定性的依据。6.3纸层析3.影响Rf的因素(1)欲别离物的性质:物质在两相的分配系数,决定了它的Rf大小;；(2)展开剂:同一组分在不同溶剂中Rf不同。通常应选这样的层析剂，使溶质的Rf在0.050.85之间,不同组分的Rf差值>0.05。(3)pH:影响它们的存在状态。(4)滤纸:质地均一、厚薄适当、具有一定机械强度、不含杂质(5).温度:在层析缸中用红外灯照射。温度会影响溶质的分配系数及流动相的扩散速度。层析操作应在恒温下进行，温度不超过±0.5oC。(6).展开方式:展开方式不同,Rf也不同。下行法的Rf最大，上行法的Rf较小，环行法的Rf也不大。四、操作技术1、载体(滤纸)〔1〕滤纸的选择a.要求滤纸质地均匀、平整无折痕边缘整齐b.要求滤纸的纤维松紧适宜c.滤纸的杂质含量少

6.3纸层析〔2〕层析滤纸的性能与规格型号杯重G/m2厚度(mm)吸水性(30min内水上升mm)灰分G/m2性能1900.17150~1200.08快速2900.17120~900.08中速3900.1590~600.08慢速41800,34151~1210.08快速51800.32120~910.08中速61800.3090~600.08慢速〔3〕滤纸的处理以0.1~0.4mol/LHCl(或2mol/LHAc)浸泡数小时,除去无机杂质后,取出用蒸馏水洗净,再将滤纸放在丙酮-乙醇(1:1)中浸泡一周时间,除去有机杂质,再取出风干备用。6.3纸层析2、固定相纸层析——以吸着在纤维素上的水作固定相。反相纸层析－用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇等作固定相。假设别离芳香油等非极性物，以石蜡油、硅油作固定相。3、试样〔1〕试样的溶解尽量防止用水。一般用乙醇、丙酮、氯仿等，最好采用与展开剂极性相似的溶剂。液体样可直接点样。四、操作技术〔2〕点样方法a、先用铅笔在距纸条一端2~3cm处划一条直线〔起始线〕并在线上隔一定距离划一“x〞号表示点样位置；见下示意图：b点样工具：微量注射器、毛细滴管〔Φ＝0.5mm)c.点样方法：用点样工具吸取试液轻轻与“x〞号接触，使点样的斑点直径为0.2~0.5cm,每次点样2~20μm于滤纸上，以冷风吹干；d.干后，将纸的两边用线缝好，以圆筒形式置于层析缸中展开。4、展开〔1〕展开剂的选择欲别离物在两相中的溶解度；展开剂的极性展开剂与欲别离物间应无化学反响欲别离物在展开剂中的分配系数最好不受温度的影响欲别离物在两相间能瞬间到达分配平衡常用的展开剂水、饱和的正丁醇、正戊醇、酚、四氯化碳、氯仿、苯、丁酮、丙酮、有机酸、有机碱，有时也参加一定比例的无机酸、无机碱、甲醇、乙醇等。〔2〕展层方法展层前，层析缸与已点样滤纸必须预先经水蒸汽、溶剂蒸气饱和。方法：将溶剂和水置于分液漏斗中充分振荡，分层后，将水层放入小烧杯内，置于层析缸中平衡一段时间，使滤纸吸饱蒸汽，然后移去小烧杯，将溶剂倒入溶剂槽中，立即将点好样的滤纸的一端浸入溶剂槽内展层。A.上行展开法将点有试样的滤纸条的下端浸入溶剂〔但不能浸没点样处〕上端固定在层析缸的上部，保持垂直，将缸密闭，使溶剂沿下端上升而展层。待溶液上升到距离纸上端3~4cm时，将滤纸取出，用铅笔在溶剂前沿处画线作记号〔见右图〕。对于Rf十分接近的物质可采取连续挥发的色谱法。纸条的上端暴露在层析缸外，以便令上升的溶剂挥发；只要保持纸条下端与溶剂面接触，溶剂便能不断地上升而挥发，展层过程就自动连续地进行；假设溶剂沸点＞100oC，那么可在纸条暴露局部用红外灯烘烤，促使溶剂挥发；该法不能测量前沿，但可达别离的目的。玻片玻璃棒原点玻皿剪成锯齿状，便于溶剂滴下B.下行展开法溶剂自滤纸条的上端向下降〔借助于重力的作用〕，具有别离速度快及连续挥发色谱的优点。C.环行法又叫径向展开法。这是一种既快又方便的方法。取一张圆形滤纸在直径的两边各画两根平行线，用剪刀沿这两根线剪至圆心处，在纸的中央滴上试液，干后，将滤纸夹在两个大小相同培养皿之间，使剪开的纸条的尾端浸入流动相。D.双向展开法

有时用一种溶剂不能将样品中组份分开时，可以试用双向展开法。该法是用正方形或长方形滤纸，在纸的一角上点样，先用一种展开剂朝一个方向展开，展开完毕，待溶剂挥发后，再用另一种展开剂朝与原来垂直的方向进行第二次展层。假设前后二次展开剂选择适当，可使各种组份完全别离。例如，氨基酸的别离可用此法。双向展开法也可以二次使用同一种展开剂展层。5、显色展层后，将滤纸从层析缸中取出，用铅笔在溶剂前沿作记号。a.

有色物：直接观察各个色斑无色物：物理法显色：用紫外灯照，观察有无吸收或发出各种不同颜色的荧光斑点，并用铅笔画下斑点的位置及大小。6、分析A.定性分析：各组分有各自的Rf。为了查明未知物的组成，最好是在同样条件下与的纯物质做对照实验。化学法显色：利用各种物质的特性反响，喷洒适当的显色剂，假设被别离的物质含有羧酸，可喷酸碱指示剂溴甲酚绿，当斑点呈黄色，说明羧酸确实存在；假设被别离的物质含有氨基酸，那么可喷茚三酮，多数氨基酸呈紫色，个别氨基酸呈黄色。其它化合物所用显色剂可从手册里查阅。xyRf

的计算:Rf=x/yx1x2yRf

的计算:Rf1=x1/yRf2=x2/y这样每一个斑点用两个Rf

来描述。B.定量分析剪洗法：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱，然后用各种仪器方法〔如红外、紫外、原子吸收、发射光谱〕测吸光度，也可将斑点剪下灰化，再用适当的溶剂溶解，测之。比较法：经纸色谱将各种组份分开后，可在相同条件下，制得标准系列图谱，与待测斑点颜色、面积进行比较，确定其可能的含量。五、纸层析的应用例１．氨基酸的别离〔固定相为水〕流动相分离情况正丁醇：2mol/LHAc=1:1酪氨酸、二碘酪氨酸用水饱和的苄醇亮氨酸、异亮氨酸叔丁醇：甲乙酮：甲酸：水＝16:16:0.1:3.9亮氨酸、异亮氨酸流动相分离情况２－丁醇：醋酸：水＝32:2:22甲状腺素、二碘酪氨酸流动相１：丁醇：HAc:H2O=4:1:5流动相２：M－甲酚－酚：pH=9.33硼酸缓冲液=1:1亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、苏氨酸、门冬氨酸、谷氨酰酸、门冬酰氨、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、胱氨酸等例2.糖的别离(固定相为水)流动相分离情况醋酸乙脂:吡啶:水=2:1:1木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖丁醇:吡啶:水=45:25:40乳糖、半乳糖、葡萄糖丁醇:乙醇:水:NH3=40:10:49:1尿中葡萄糖丁醇:乙醇:水=10:1:2蜜二糖、果糖、葡萄糖、流动相分离情况流动相１：酚流动相２：丁醇:醋酸:水=1:1:1鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖醛酸丁醇:乙醇:水=4:1:5低聚糖75%2－丙醇：醋酸＝9:1直链淀粉丁醇:吡啶:水：苯=50:30:3:45棉子糖例３．脂肪酸的别离〔固定相为水〕流动相分离情况95%乙醇：浓氨水＝100:1同系的直链脂肪酸正己醇：1.5mol/L氨水＝1:1烷氧基酸流动相1:乙醇：浓氨水:H2O=80:5:15流动相2：乙二醇乙醚：桉树脑：88%甲酸=5:5:2草酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、羟基醋酸、顺丁烯二酸、丙二酸、乳酸、琥珀酸、乌头酸、己二酸、延胡索酸、葵二酸流动相分离情况丁醇：醋酸：水＝4:1:5甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、苯苄胺甲醇：戊醇：苯：水＝4:2:2:2－萘胺、间苯二胺、对苯二胺、苯胺丁醇：1.5mol/L氨水＝1:1C7以下的脂肪酸例4.胺类的别离〔固定相为水〕例5.醇、酚的别离〔固定相为水〕流动相分离情况丁醇：5%NaHCO3＝1:1甲醇、乙醇、异丙醇、异丁醇、异戊醇、辛醇己烷饱和甲醇乙醇、异丙醇、丙醇、异丁醇、正丁醇丁醇：乙醇：水＝4:1.1:1.9乙二醇、丙三醇、甘露糖醇、山梨醇、肌醇流动相分离情况丁醇：醋酸：水＝4:1:5苯甲酸、儿茶酚、肉桂酸、邻香豆酸、没食子酸、间羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、5-甲基苯二酚、间苯三酚、2,4,6－三羟基苯甲酸、2,4－二羟基苯甲酸、1,2,3－苯三酚、对苯二酚、间苯二酚、β－羟基苯甲酸、邻羟基苯甲酸、香草酸例６核酸降解物〔核苷酸、嘌呤、嘧啶碱基〕的别离〔固定相为水〕流动相分离情况饱和(NH4)2SO4：水：2－丙醇＝79:10:2鸟嘌呤、腺嘌呤、胞苷正丁醇：水：乙二醇：醋酸＝5:1:5:2AMP、ADP、ATP正丁醇：二苷酸：0.1mol/LHCl＝4:1:1黄嘌呤、鸟嘌呤正丁醇：二苷酸：水＝4:1:1腺嘌呤、次黄嘌呤例７.其它类的别离〔固定相为水〕流动相分离情况正丁醇：浓氨水：水＝4:1:5磺胺嘧啶、磺胺噻睉、Sulfamerzine、p,p’-sulfonyldianiline正丁醇：醋酸：水＝4:1:5对胺基苯甲酸、维生素C、N－甲基－菸酰胺、菸碱酰胺、菸酸、潘妥宁、泛酸、VB6、VB1VB甲苯：石油醚：乙醇：水＝200:100:30:70雌酮、雌二酮、雌三酮、马烯雌酮、脱氢皮质甾酮酸、孕甾酮、顺式睾丸甾酮流动相分离情况丁醇：浓盐酸＝98:2阿托品、莨菪胺、后马托品、莨菪碱、、d－古苛碱、d－假古苛碱、托把柯卡因、金雀花碱、高金雀花碱、吗啡、可待因、蒂巴因、海洛因、那可叮、可它宁、北美黄莲碱、马钱子碱、二甲马钱子碱、奎咛、辛可宁、辛可宁啶、毛果碱、异毛果碱、毛果心碱、菸碱、吡啶、胆碱、乙酰胆碱、波尔啶碱、槟榔碱例8．无机应用〔固定相为水〕流动相分离情况12mol/LHCl：甲醇：丁醇：甲基异丁酮＝55:35:5:5K+、Rb+

、Cs+乙醇：水＝80:20Li+

、Na+

、K+10%HCl的水饱和丁醇Zn2+－Ga3+－In3+

－Al3+苯酚：甲醇：HCl＝5:3:2Al3+

－Ga3+

－In3+

－Tl3+流动相分离情况丁醇：HAc：乙酸乙脂：水＝10:2:1:7从Fe、Al、Ti中分离出Ga乙酸乙脂：水：HNO3＝85:10:5从稀土、Zr、Ti、Th中分离出Sc乙醚：浓HNO3＝87.5:12.5Hf－Zr4mol/LHCl饱和丁醇UO2－Th例9．生物学应用FeCuCoNiNiNiNiTiMo黑毛红毛黄毛白毛兔毛的色谱图以兔毛作实验，别离结果如右图。取不同颜色兔毛(300~500mg),干法灰化,溶于稀HCl中,用丙酮:丁醇:HCl=10:4:2,展开后,显色6.4薄层色谱薄层层析薄层层析：把固定相吸附剂铺在玻璃板上铺成均匀的薄层，层析就在玻璃板上的薄层中进行。把试样点在层析板的一端，把层析板放入层析缸中，使点有样品的一端浸入流动相展开剂中，试样中的各种组分沿着薄层在固定相和流动相之间不断地发生溶解、吸附、再溶解再吸附的分配过程，以致相互分开。6.4薄层色谱法一、薄层层析的特点[优点]快速：只需10-60min别离效率高，灵敏度高装置简、操作方便样品负荷量大、斑点扩散少[缺点]Rf值的重复性差[克服方法］标样和试样在同一块板上展开二、固定相〔吸附剂〕决定吸附性能的因素：吸附剂的化学组成、活性、外表积。［要求］：适宜的吸附力与展开剂、被吸附物质均不起化学反响粒度细小而且均匀〔范氏方程，减少涡流扩散项〕6.4薄层色谱法(1).氧化铝氧化铝呈微弱碱性，酸性较强的化合物在氧化铝上吸附的很牢〔所以，酸性物质别离不好〕，故通常用于别离碳氢化合物、生物碱类和对碱性物质比较稳定的中性物质、碱性物质。一般要求薄板用的活性为Ⅱ~Ⅲ级氧化铝的活性与含水量密切相关〔含一定量的水份时，吸附剂外表的吸附中心回被水分子占据〕。活性ⅠⅡⅢⅣⅤ含水量（％）０３６１０１５故加热驱除水——活化；吸附一定量的水——失活Δ100~150oC,除去Al2O3中与羟基结合的局部水份，使Al2O3有一定的活性；Δ150~300oC，Al2O3活性达Ⅱ～Ⅲ级；Δ300~400oC，Al2O3活性达Ⅰ～Ⅱ级；Δ>600oC，Al2O3进一步脱水并开始烧结。由于脱水过程受到许多因素的影响，因此，每批生产的Al2O3，其外表积和外表孔穴结构并不一致，活性也不相同。Al2O3活性的测定：取20µL染料溶液〔偶氮苯30mg、对－甲氧基偶氮苯、苏丹黄、苏丹红、和对氨基偶氮苯各20mg，溶解于50mLCCl4中〕，加到薄板上，用CCl4展层，根据下表确定活性。活性ⅡⅢⅣⅤRf,偶氮苯0.590.740.850.95Rf,对-甲氧基偶氮苯0.160.490.690.89Rf,苏丹黄0.010.250.570.78Rf,苏丹红0.000.100.330.56Rf,偶氮苯0.000.030.080.19市售的供薄层色谱用的Al2O3有:Al2O3－H氧化铝中无粘合剂Al2O3－G氧化铝中含煅石膏〔一般5％煅石膏〕［煅石膏CaSO4，作为粘合剂］Al2O3－HF254氧化铝中不含煅石膏，仅含荧光指示剂〔在254nm下呈黄绿色荧光〕Al2O3－GF254氧化铝中既含煅石膏又含荧光指示剂〔在254nm下呈黄绿色荧光〕上述商品可以直接调料涂敷〔1份料，2份水调和〕〔２〕硅胶〔吸附性较Al2O3弱〕硅胶是微酸性吸附剂，且适用于酸性、中性物质的别离〔如有机酸、氨基酸、萜类、甾体〕。碱性物质那么能与硅胶作用〔当用中性溶剂展层，碱性物质有时停留在原点不动，或者得到拖尾的斑点，而不能很好的别离〕。活性ⅠⅡⅢⅣⅤ含水量（％）

05152535注:硅胶薄层的活化温度不能高于200oC硅胶的结构为:硅胶活性的测定：称取二甲黄、苏丹红、靛酚蓝各40mg溶于100mL苯中，将此混合液滴加于薄层上，用石油醚展开10cm，混合物应不动；如用苯展开，那么应分成三个斑点，其Rf值分别为：二甲黄0.58，苏丹红0.19，靛酚蓝0.08〔展层时间30~45min〕，那么认为此硅胶合格。经本法测定的活性与Al2O3活性Ⅱ~Ⅲ级相当。薄层用商品硅胶有：硅胶H〔不含粘结剂〕硅胶G〔含粘结剂煅石膏〕硅胶HF254〔含荧光物质的硅胶〕硅胶GF254〔含有煅石膏和荧光剂〕

此外，硅藻土、硅酸盐、杂多酸盐、聚酰胺、纤维素也可用作吸附剂。选择吸附剂的规律：极性物质被极性外表的吸附剂吸附；亲水性的吸附剂适用于在非水溶液中吸附物质疏水性的吸附剂适用于在水溶液中吸附物质三、铺层方法1．干法铺层——“干板或软板〞适用于颗粒粗，别离效率差。氧化铝常用此法，2．湿法铺层：加水或其它溶液调糊状——“硬板〞倾倒法：〔根据玻璃面积及铺层厚度〕称取一定量吸附剂，按比例加水〔或其它溶液〕调糊状，立即倾倒在玻璃上大致推开，轻轻颠动玻璃板，使其自动成均匀薄层，水平放置10～20min结后阴干备用或活化后备用刮层法〔1〕制板A、玻璃板a.平整、去油、去污〔可用浓H2SO4-K2CrO7洗液浸洗，或丙酮擦洗，自来水洗净后，烘干〕b.玻璃板的尺寸根据自己的需要自由选择，小的可用2.57.5cm的载玻片,大的可用2020cm的玻片。B、涂布液取一定量的吸附剂放入研钵中，参加需要的水或适当的溶剂，研磨时间以调成稀糊状为度，当浓度均一后，即成胶状物，色泽洁白为最正确，立即倾入玻璃板上，用下述方法涂布。涂布方法玻棒涂布玻片刮涂倾斜涂布〔利用流平性〕：简单，但均匀性差涂布器层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂〔硅胶或氧化铝，200～250目〕均匀地涂在长条形玻璃板上〔厚度0.15～0.5mm〕。枯燥后即可使用。〔2〕活化薄板首先风干，否那么湿板一下加热到高温，烘出的薄板很酥松，使用效果不好。氧化铝G板在150~160oC,烘4小时(Ⅱ级左右)硅胶G板在110oC烘1小时薄板经活化后，一定要储藏在密闭的枯燥器或烘箱中备用。四、展开剂、点样和展开1．展开剂的选择吸附层析：根据极性的不同来选择流动相a．活度小b．微量环技术c．微型薄层分配层析：根据试样中各组分在展开剂中溶解度的不同和纸层析相似展开剂的选择2、点样：快，量适当适当的点样量，集中的斑点是得到一个好的层析的必要条件。如何才适当？不同的别离要求、不同的薄板〔有厚有薄〕、不同的吸附剂〔性能不一〕，需要不同的点样量。从以下图可见：点样量少了，不易检出；点样量多了，易拖尾或扩散，影响别离效果。0.12503000.50.30.1Rfg

用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在原点上。试样点的直径一般应小于5mm。可并排点多个试样同时展开。15cm2.5cm1.5cm溶剂前沿纯物质的鉴定，假设又有高灵敏度的显色剂，点样量只需g或ng；假设进行天然物或中间产物的别离时，点样量需50g~几百微克；假设进行制备色谱，进样量可达1mg。点样时可用内径约1mm，管口平整的毛细管或微量吸管吸取试液后，轻轻接触板面，分数次滴加样品。注意点：a.溶解试样的溶剂最好是挥发性的b.点样宜分几次点加,即点一次后,用吹风机的冷风吹干,再点,再吹干,.......,反复,直到点完所要求的量c.点样量的体积尽可能小些(2~10L左右)d.点样最好是在密闭的室中或比较枯燥的环境下完成,防止薄板吸水降低活性.3、展开薄层的展开需在密闭的器皿中进行，密闭容器应用展开溶剂预先饱和。展开方式和纸层析相同。但不加粘合剂的薄板只能作近水平展开〔与平面成10~20o倾角〕的上行或下行展层而不能垂直展层。a.上行展开：把点好样品的薄板浸入0.5cm深的适宜展开剂中，当展开剂移动至离起点约10~20cm处(约30min)，将薄板取出放平，用铅笔或小针记下溶剂前沿的位置后，在室温枯燥或烘箱内枯燥，测其Rf值。注意：每次的展层距离要固定，以便Rf值的重复五、薄层层析中定性检出和定量测定1．定性：展开完毕，取出记下展开剂前缘位置A、显色：a.紫外光照射b.蒸气熏：固体碘，浓氨水，溴c.喷显色剂：雾滴细而均匀防止损伤薄层外表B、计算Rf值,与文献值对照由于Rf值受诸多因素的影响，最好用标准物在同一板上展开比较。定性检出a.本身是有色物，可以直接观测斑点的位置和颜色；b.本身无色但在紫外线的照射下会发出不同颜色的荧光c.薄板本身有荧光〔硅胶HF254+366,硅胶GF254,......),欲测物吸收紫外