双水相萃取法

双水相萃取法第1页，课件共56页，创作于2023年2月基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固-液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。因此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。第2页，课件共56页，创作于2023年2月其中双水相萃取技术(two-aqueousphaseextraction,ATPS)，又称水溶液两相分配技术(Partionoftwoaqueousphaseextraction)是近年来出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可以连续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质2～5倍，与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率上还是成本上都要优越得多。第3页，课件共56页，创作于2023年2月双水相萃取法和传统的分离方法(如盐析或有机溶剂沉淀等)相比也有很大的优势，如以β-半乳糖苷酶为例，用沉淀或双水相萃取纯化的比较见下表。除此以外，处理量相同时，双水相萃取法比传统的分离方法,设备需用量要少3～10倍，因此已被广泛地应用在生物化学、细胞生物学和生物化工领域，进行生物转化、蛋白质、核酸和病毒等产品的分离纯化和分析等。用此法来提纯的酶已达数十种，其分离过程也达到相当规模，如乙醇脱氢酶的分离已达到几十千克湿细胞规模，β-半乳糖苷酶的提取也到了中试规模等。第4页，课件共56页，创作于2023年2月聚合物的不相溶性(incompatibility)：当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相容性。可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇(polyethyleneglycol,

PEG)/葡聚糖(dextran，Dx)，聚丙二醇(polypropyleneglycol)/聚乙二醇和甲基纤维素(methylcellulose)/葡聚糖等。双水相萃取中常采用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相，例如，PEG/磷酸钾(KPi)、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于生物产物的双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG，下相富含无机盐。1双水相系统第5页，课件共56页，创作于2023年2月均相区图a和b分别为PEG/Dx和PEG/KPi系统的典型相图a双节线系线b双节线均相区均相区两相区两相区系线临界点第6页，课件共56页，创作于2023年2月在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即

系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时，即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为1，因此K点称为临界点(criticalpoint)。

上下相组成分别为T和B,第7页，课件共56页，创作于2023年2月第8页，课件共56页，创作于2023年2月2.双水相中的分配平衡

与溶剂萃取相同，溶质在双水相中的分配系数也用m=c2/c1表示。为简便起见，用c1和c2分别表示平衡状态下下相和上相中溶质的总浓度。有关双水相系统中溶质分配平衡的理论已有很多研究报导。但是，由于影响双水相系统中溶质分配平衡的因素非常复杂，很难建立完整的热力学理论体系。从双水相萃取过程设计的角度出发，确定影响分配系数的主要因素是非常重要的。第9页，课件共56页，创作于2023年2月已有的大量研究表明，生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生物亲和作用等。因此，分配系数是各种相互作用的和:lnm=lnme+lnmh+lnmlme，mh，ml分别为静电作用、疏水作用和生物亲和作用对溶质分配系数的贡献。第10页，课件共56页，创作于2023年2月1．静电作用非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影响，利用相平衡热力学理论可推导下述分配系数表达式：lnm=-Mλ/RTm-分配系数；M-溶质的相对分子质量；λ-与溶质表面性质和成相系统有关的常数;R-气体常数，J/(mo1．K)；T-绝对温度，K。因此，溶质的分配系数的对数与相对分子质量之间呈线性关系，在同一个双水相系统中，若λ>0，不同溶质的分配系数随相对分子质量的增大而减小。同一溶质的分配系数随双水相系统的不同而改变，这是因为式中的λ随双水相系统而异。第11页，课件共56页，创作于2023年2月第12页，课件共56页，创作于2023年2月实际的双水相系统中通常含有缓冲液和无机盐等电解质，当这些离子在两相中分配浓度不同时(即分配系数≠1)，将在两相间产生电位差，此时，荷电溶质的分配平衡将受相间电位的影响，从相平衡热力学理论推导溶质的分配系数表达式为lnm=lnmo+ΔφFZ/RT

因此，荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比,由于同一双水相系统中添加不同的盐产生的相间电位不同，故分配系数与净电荷数的关系因无机盐而异.电位差，总电荷气体常数第13页，课件共56页，创作于2023年2月2．疏水作用一般蛋白质表面均存在疏水区，疏水区占总表面积的比例越大，疏水性越强。所以，不同蛋白质具有不同的相对疏水性。在pH为等电点的双水相中，蛋白质主要根据表面疏水性的差异产生各自的分配平衡。同时，疏水性一定的蛋白质的分配系数受双水相系统疏水性的影响。因此，有必要确定双水相系统的疏水性尺度，以便在萃取操作时调整和设计蛋白质的分配系数。PEG/Dx和PEG/无机盐等双水相系统的上相(PEG相)疏水性较大，相间的疏水性差用疏水性因子HF(hydrophobicfactor)表示。HF可通过测定疏水性已知的氨基酸在其等电点处的分配系数maa测算第14页，课件共56页，创作于2023年2月lnmaa=HF(RH+B)其中，RH为氨基酸的相对疏水性(relativehydrophobicity)，是通过测定氨基酸在水和乙醇中溶解度的差别确定的，并设疏水性最小的甘氨酸的RH＝0。B=lnmGly/HF所以，pH＝pI时氨基酸在双水相系统中的分配系数与其RH值呈线性关系，直线的斜率就是该双水相系统的HF值。第15页，课件共56页，创作于2023年2月利用前式可确定不同双水相系统的HF值。如果在pH为等电点的双水相中蛋白质的分配系数(m0)与HF值之间呈线性关系，则直线的斜率定义为该蛋白质的表面疏水性，用HFS(hydrophobicfactorofsolutes)表示lnm0=HF×HFS一般形式lnm=HF(HFS+ΔHFS)+ΔφFZ/RT

该式较全面地描述了双水相系统的疏水性和相间电位、蛋白质的疏水性和净电荷数对分配系数的影响，同时也间接地通过盐对蛋白质表面疏水性和相间电位的影响表现了盐对蛋白质分配系数的作用。第16页，课件共56页，创作于2023年2月3.影响物质分配平衡的因素

影响物质在双水相系统中分配的因素主要有双水相系统的聚合物组成(包括聚合物类型、平均分子量)，盐类(包括离子的类型和浓度、离子强度、pH值)，溶质的物理化学性质(包括分子量、等电点)以及体系的温度等。然而，这些参数并不是独立地起作用。所以要预测溶质在双水相系统间的分配系数是困难的。这些系统复杂性表现在如下的一些例子中：在一相中引入疏水性基团会影响离子的分配和电位，在大分子(亲水聚合物或蛋白质溶质)结构中构象的变化，能使另一些原子暴露在微环境中。这些事实导致只能用实验的方法来确定满足分配要求的操作条件。

第17页，课件共56页，创作于2023年2月3.1双水相中聚合物组成的影响双水相系统作为一种成功的萃取方法，很大程度上取决于使用的聚合物类型，当两种不同聚合物的溶液混合时，可能存在三种情况：a完全混溶性(匀相溶液)；b物理的不相溶性(相分离)；c复杂的凝聚(相分离,聚合物聚集在同一相中，纯溶剂-水聚集在另一相中)。离子和非离子聚合物都可以使用在双水相系统的构成上，但是，当这两种聚合物是离子化合物并带有相反电荷时，它们互相吸引并发生复杂的凝聚。第18页，课件共56页，创作于2023年2月3.2双水相系统物理化学性质的影响双水相系统的性质主要取决于下列物理化学参数：密度(ρ)和两相间的密度差，黏度(μ)和两相间的黏度差以及表面张力(σ)。第19页，课件共56页，创作于2023年2月系线长度代表了系统达到平衡时上、下相和总组成的关系，在临界点附近系线的长度趋向于零，上相和下相的组成相同，因此,分配系数应该是1。随着聚合物和成相盐浓度增大，系线的长度增加,上相和下相相对组成的差别就增大，产物如酶在两相中的界面张力差别也增大，这将会极大地影响分配系数，使酶富集于上相。第20页，课件共56页，创作于2023年2月3.3盐和缓冲液的影响

盐的种类和浓度对分配系数的影响主要反映在对相间电位和蛋白质疏水性的影响。在双聚合物系统中，无机离子具有各自的分配系数，不同电解质的正负离子的分配系数不同，当双水相系统中含有这些电解质时，由于两相均应各自保持电中性，从而产生不同的相间电位，因此，盐的种类(离子组成)影响蛋白质、核酸等生物大分子的分配系数，盐浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相体积比。例如，PEG/KPi系统中上、下相(或称轻重相)的PEG和磷酸钾浓度以及Cl离子在上、下相中的分配平衡，随添加NaCl浓度的增大而改变。这种相组成即相性质的改变直接影响蛋白质的分配系数。离子强度对不同蛋白质的影响程度不同，利用这一特点，通过调节双水相系统中的盐浓度，可有效地萃取分离不同的蛋白质。在不同的双水相体系中盐的作用也不相同。在PEG/磷酸盐/水中加入氯化钠可以使万古霉素的分配系数由4提高到120,而在PEG/DEX/水体系中只从1.55提高到5。第21页，课件共56页，创作于2023年2月3.4

温度的影响温度影响双水相系统的相图，因而影响蛋白质的分配系数。但一般来说，当双水相系统离双节线足够远时，温度的影响很小，1-2度的温度改变不影响目标产物的萃取分离。第22页，课件共56页，创作于2023年2月大规模双水相萃取操作一般在室温下进行，不需冷却。这是基于以下原因：(1)成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋白质一般不会发生失活或变性；(2)常温下溶液粘度较低，容易相分离；(3)常温操作节省冷却费用。第23页，课件共56页，创作于2023年2月在生物分子回收和纯化以后，怎样从含有目标产物残余物的水溶液中回收聚合物或盐就成为一个重要的问题。例如从1000kg面包酵母中萃取反丁烯二酸酶需要用680kgPEG-1550和533kgK3PO4，若不回收利用，化学品的消耗会使生产成本大幅度上升。如果产品是蛋白质，并且分配在盐相，则盐可以在错流过程操作方法下，用超滤或渗析膜过滤回收。如果蛋白质积聚在聚乙二酵中，可以通过加入盐来精制，加入的盐导致蛋白质在盐相中重新分配。PEG的分离同样可以用膜分离来实现，即用选择性孔径大小的半透膜来截留蛋白质，同时排除PEG进行回收。另一种力法是通过盐析或使用水-可混溶性的溶剂来沉淀蛋白质，但是固体(产物)的去除被存在的PEG阻碍。也可使用离子交换和吸附，它们是通过蛋白质与基质的选择性相互作用进行的。然而，当黏性聚合物溶液通过柱被处理的时候，会出现高的压力降。在上述的三种方法中，膜分离是分离和浓缩被纯化的蛋白质并同步去除聚合物的最佳方法。第24页，课件共56页，创作于2023年2月亲和双水相技术亲和双水相技术是指在成相高聚物上偶联亲和性配基,以提高溶质的分配系数。这种技术已经广泛地运用到蛋白质等生物大分子的分离纯化工艺中。万古霉素可以和二肽N-乙酰-D-Ala-D-Ala形成复合物,当二肽作为配基与活性MPEG共价结合后,加入到PEG/DEX系统中,不仅大大提高了系统的选择性,而且分配系数提高了7倍。丙氨酸

第25页，课件共56页，创作于2023年2月4.

双水相系统的应用双水相萃取自发现以来，无论在理论上还是实践上都有很大的发展。在最近几年中更为突出,在若干生物工艺过程中得到了应用，其中最重要的领域是蛋白质的分离和纯化，其应用举例如表所示。第26页，课件共56页，创作于2023年2月现举例介绍具体的分离、纯化方法。

A酶的提取和纯化双水相的应用始于酶的提取。由于PEG/精Dextran体系太贵，而粗Dextran粘度又太大,故目前研究相应用较多的是PEG/盐体系。下表中列出一些应用的实例。第27页，课件共56页，创作于2023年2月在这些体系中，酶主要分配在上相，菌体在下相或界面上。料液中湿细胞含量可高达30%，酶的提取率达90%以上。如果条件选择合适，不仅可从发酵液提取酶，实现它与茵体的分离。而且还可将各种酶互相分离，

B核酸的分离及纯化用PEG/Dextran体系萃取核酸时，盐组成的微小变化将会引起分配系数的急剧变动。

C人生长激素的提取用PEG40006.6％／磷酸盐14％体系从E.coli碎片中提取人生长激素(hGH)，当pH值＝7及菌体含量为35％(w／v)干细胞，混合5-10秒钟后，即可达到萃取平衡．hGH分配在上相，其分配系数高达6.4，相比为0.2，收率大于60％，对蛋白的纯化系数为7.8。如若进行三级错流萃取，总收率可达81％，纯化系数为3.5。第28页，课件共56页，创作于2023年2月

Dβ干扰素(β-IEN)的提取双水相萃取持别适用于β干扰素这些不稳定的、在超滤或沉淀时易失活的蛋白质的提取和纯化,β干扰素是合成纤维细胞或小鼠体内细胞的分泌物。培养基中总蛋白浓度为1g/L而它的浓度仅为0.1mg/L。用一般的PEG／Dextran体系，不能将β干扰素与主要杂蛋白分开，必须是具有带电基团或亲和基团的PEG衍生物如PEG—磷酸酯与盐的系统才能使β干扰素分配在上相，杂蛋白完全分配在下相而得到分离。并且β干扰素的浓度越高，分配系数越大，纯化系数甚至可高达350。这一技术已用于1×109单位的β干扰素的回收。收率达97%，干扰素的特异活性＞1×l06单位/mg蛋白。这一方法与层析技术相结合，组成双水相萃取—层析纯化联合流程、已成功地用于工业生产。

第29页，课件共56页，创作于2023年2月E病毒的分离纯化当病毒进入双水相体系后，在上相和下相间也会发生选择性分配，表现出一定的分配系数。双水相萃取技术的进展从上可见双水相萃取技术不但用于生物物质的分离和纯化，而且己成为一种新的分析测试手段。近年来还有了新的进展，主要有两个方向：廉价双水相体系的开发在生化工程中得到应用的两种双水相体系，即高聚物—高聚物和高聚物—盐体系。这两种体系比较见下表：

第30页，课件共56页，创作于2023年2月从表可见，高聚物—高聚物体系对活性物质变性作用小，界面吸附少，但价格高因而寻找廉价的高聚物：高聚物双水相体系是双水相萃取技术应用的一个重要发展方向。第31页，课件共56页，创作于2023年2月目前比较成功的是用变性淀粉PPT(hydroxypropydertvativeofStarch)代替昂贵的dextran。PPT—PEG体系已被用来从发酵液中分离过氧化氢酶、β—半乳糖苷酶等。PPT—PEG体系比PEG—盐体系稳定。和PEG—dextran体系相图非常相似，并具有以下优点：

(1)蛋白质溶解度大。蛋白质在PPT浓度到l5％以前没有沉淀，但在PEG浓度大于5％时，溶解度显著地减小，在盐溶液中的溶解度更小。

(2)粘度小。PPT的动力粘度只是粗dextran的1／2，因而可以大大改善传质效果。

(3)价格便宜。PPT价格为每千克几十美元，而粗Dextran则要每千克几百美元，所以PPT—PEG双水相体系具有更广泛的应用前景。第32页，课件共56页，创作于2023年2月液-液双水相萃取分离α-淀粉酶α-淀粉酶是广泛应用的生物酶类，B.Subtilis细菌α-淀粉酶是研究和应用较多的α-淀粉酶，其分子量为48000道尔顿，PI约为5，最适pH5.3-6.4，在pH4.8-8.5之间稳定。实验研究了α-淀粉酶在聚乙二醇（PEG）/磷酸盐双水相系统中的分配，PEG分子量、PEG浓度、pH、添加NaCl和酶浓度等因素对α-淀粉酶分配系数影响。第33页，课件共56页，创作于2023年2月PEG：分子量为400，1000，4000和6000α-淀粉酶在PEG/磷酸盐系统的分配系数系统K

PEG400（13.2%w/w）磷酸盐（16.8%w/w）20.42PEG1000(11.5%w/w)磷酸盐(13.4%w/w)17.62PEG4000(10%w/w)磷酸盐(11.5%w/w)1.75PEG6000(7.5%w/w）磷酸盐（10%w/w）0.35贵州啤酒厂

第34页，课件共56页，创作于2023年2月双水相萃取法在天然产物纯化中的应用传统双水相系统在中药有效成分纯化中的应用中药成分双水相体系分离效率甘草酸聚乙二醇/硫酸铵92.2%

芦丁聚乙二醇/吐温/硫酸铵95.0%

银杏黄酮聚乙二醇/磷酸钾98.2%

水杨酸乙二醇/聚乙烯吡咯烷酮/硫酸铵102.10%

第35页，课件共56页，创作于2023年2月双水相萃取法应用于从白萝卜中提取过氧化物酶不同工艺制备过氧化物酶的各项指标粗酶传统盐析法双水相萃取法蛋白含量(mg)132.5732.4094.196比活(O.D./mg·min)0.07743.30831.173纯化倍数559.5402.8总酶力10.2104.3130.8提取率/%0.06630.00120.0021第36页，课件共56页，创作于2023年2月双水相体系在金属离子分离中的应用第37页，课件共56页，创作于2023年2月金属离子间的双水相体系液-液萃取分离是在高聚物/盐/萃取剂中,通过控制一定的条件,使目的金属离子被定量萃取到高聚物相,其它金属离子不被萃取而留在下层水相,从而实现混合金属离子之间的分离。第38页，课件共56页，创作于2023年2月双水相生物催化技术双水相生物催化技术的基本原理是:利用两种不同高聚物的水溶液或一种高聚物和一种无机盐的水溶液,因其浓度不同而形成互不相溶的两液相体系,调整浓度将反应物和生物催化剂分配于下相,产物分配于上相,实现生物反应与产物分离的耦合。该技术有利于消除产物抑制和解决催化剂回收问题,提高催化反应的效率,简化产物的分离工艺,降低投资和操作费用。用青霉素G酰基转移酶为催化剂,在以PEG400/硫酸镁组成的双水相体系中合成头孢氨苄,酶反应35h后仍然有80.16%的活力。产物的产率可以达到60%,而传统反应体系中产率只能达到21%。用水溶性高聚物EudragitS2100固定化糜蛋白在PEG/Dextran双水相体系中催化酪蛋白水解,84%的产物分配到了dextran相,而酶可以通过体系pH值的降低(pH7.16～3.18)从PEG相中分离出来,然后再回调pH值即可重新溶解、重复使用。第39页，课件共56页，创作于2023年2月双水相萃取泰乐菌素泰乐菌素是禽畜专用的大环内酯类抗生素,能预防和治疗各种禽畜多发病症,在国际上被广泛用作饲料添加剂,在国内需求量也很大。提取部分的成本占到总生产成本的70%左右。

14%PEG4000和20%Na2HPO4

构成的双水相对泰乐菌素进行全发酵液萃取,小试收率52.14%,省去了过滤操作,只需调节一次pH,减少了泰乐菌素的失活,纯度明显提高。第40页，课件共56页，创作于2023年2月双水相萃取与其他技术联用第41页，课件共56页，创作于2023年2月选讲内容：反相胶束（胶团）反相胶团是表面活性剂分子溶于非极性溶剂中自发形成的聚集体,其中表面活性剂的极性头朝内而非极性头朝外与有机溶剂接触。胶团内可溶解少量水而形成微型水池。反胶团溶液是宏观上透明均一的热力学稳定体系。第42页，课件共56页，创作于2023年2月1，反胶团的萃取原理蛋白质进入反胶团溶液是一协同过程。在有机溶剂相和水相两宏观相界面间的表面活性剂层,同邻近的蛋白质分子发生静电吸引而变形,接着两界面形成含有蛋白质的反胶团,然后扩散到有机相中,从而实现了蛋白质的萃取。改变水相条件(如pH值、离子种类或离子强度),又可使蛋白质从有机相中返回到水相中,实现反萃取过程。第43页，课件共56页，创作于2023年2月p154第44页，课件共56页，创作于2023年2月2.反胶团的制备1）注入法：将蛋白质水溶液直接注入到含有表面活性剂的有机溶剂中，搅拌，形成透明的溶液2）相转移法：将蛋白质水相与含表面活性剂的有机相接触3）溶解法：将含反胶团的有机相与蛋白质固体粉末一起搅拌（非水溶性蛋白质）第45页，课件共56页，创作于2023年2月反胶团萃取原理有机相、水相间的分配萃取第46页，课件共56页，创作于2023年2月蛋白质的溶解第47页，课件共56页，创作于2023年2月（四）在分离工艺中的应用2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠

第48页，课件共56页，创作于2023年2月2，反相胶团萃取的优点成本低选择