实验一蛋白质的等电点测定和沉淀反应

实验一蛋白质的等电点测定和沉淀反应第1页，课件共28页，创作于2023年2月一、实验目的1、了解蛋白质的两性解离性质2、学习测定蛋白质等电点的一种方法3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义5、了解蛋白质变性与沉淀的关系

第2页，课件共28页，创作于2023年2月二、实验原理蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡：蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。第3页，课件共28页，创作于2023年2月当溶液的pH为一定值时，蛋白质极性基团解离的正负离子数相等，净电荷为0，此溶液的pH值为该蛋白质的等电点。不同蛋白质具有各自特定的等电点，与该蛋白质的组成结构有关。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用性质的变化测定各种蛋白质的等电点。常用方法：测其溶解度最低时的溶液pH值。问题：蛋白质等电点的测定还有哪些方法?第4页，课件共28页，创作于2023年2月本实验通过观察不同pH溶液中酪蛋白的溶解度来测定其等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同pH值的缓冲液。向各缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。第5页，课件共28页，创作于2023年2月在水溶液中，蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体。在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类。第6页，课件共28页，创作于2023年2月可逆的沉淀反应

蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如：盐析作用、低温下用乙醇（丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。问题：提纯蛋白质时常用的沉淀方法有哪些?第7页，课件共28页，创作于2023年2月不可逆沉淀反应蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。问题：这些不可逆的沉淀反应有哪些应用?第8页，课件共28页，创作于2023年2月蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。第9页，课件共28页，创作于2023年2月三、试剂器材1、实验材料鸡蛋清牛奶2、仪器设备

水浴锅温度计锥形瓶100mL容量瓶吸管试管及试管架

第10页，课件共28页，创作于2023年2月0.4%酪蛋白乙酸钠溶液：取20mL牛奶，加入10mL1mol/LNaAC,用去离子水定容至100mL

1.00mol/L醋酸溶液0.10mol/L醋酸溶液0.01mol/L醋酸溶液3、试剂第11页，课件共28页，创作于2023年2月蛋白质溶液：5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清:水=1:9）0.2M醋酸-醋酸钠缓冲液，pH4.73%硝酸银溶液5%三氯乙酸溶液95%乙醇饱和硫酸铵溶液：25℃，100mL水＋76.7g硫酸铵0.1M盐酸溶液0.1M氢氧化钠溶液0.05M碳酸钠溶液0.1M醋酸溶液甲基红溶液：pH变色范围为4.4-6.2，由红变黄

第12页，课件共28页，创作于2023年2月四、实验操作（一）酪蛋白等电点的测定（1）取4支试管，按下表顺序分别加入各试剂，混匀。试管号蒸馏水mL0.01M醋酸mL0.1M醋酸mL1.0M醋酸mL18.40.6-—28.7-0.3—38.0-1.0—47.4--1.6第13页，课件共28页，创作于2023年2月（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4管的pH依次为5.9、5.5、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊（有颗粒沉淀）的一管pH即为酪蛋白的等电点。第14页，课件共28页，创作于2023年2月（二）蛋白质沉淀实验第15页，课件共28页，创作于2023年2月1.蛋白质的盐析加5%卵清蛋白溶液5mL于试管中，再加等量饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。离心，取沉淀，加少量水，观察是否溶解。离心后上清液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。离心，取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀能否重新溶解。第16页，课件共28页，创作于2023年2月2.重金属离子沉淀蛋白质取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加3%硝酸银溶液1~2滴，振荡试管，有沉淀产生。离心倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？

第17页，课件共28页，创作于2023年2月3．有机酸沉淀蛋白质取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加1mL5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。离心倾去上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。第18页，课件共28页，创作于2023年2月4．有机溶剂沉淀蛋白质取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入2mL95%乙醇。混匀，观察沉淀的生成。第19页，课件共28页，创作于2023年2月5．乙醇引起的变性与沉淀

取3支试管，编号，依下表顺序加入试剂：

试剂

mL

管号

5%卵清蛋白0.1M氢氧化钠0.1M盐酸pH4.7缓冲液

95%乙醇

111121113111第20页，课件共28页，创作于2023年2月振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加水8mL。在2、3号管中各加一滴甲基红，分别用0.1M醋酸溶液及0.05M碳酸钠溶液中和。观察颜色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1M盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现象。提示：卵清蛋白等电点4.7第21页，课件共28页，创作于2023年2月实验结果与分析：按照实验报告要求记录实验结果并分析。研讨：通过本次实验，有否对该项目改进的合理建议。

解释盐析、有机溶剂、等电点、重金属、有机酸沉淀蛋白质的不同机理。查阅资料，介绍蛋白质等电点的测定方法。查阅资料，介绍生物大分子制备常用的沉淀方法。蛋白质变性有哪些方面的应用？大组总结交流（PPT）：内容：实验结果与分析，课后研讨题，实验体会等。五、实验结果与报告第22页，课件共28页，创作于2023年2月实验结果管号pH值混浊度解释现象1234（一）酪蛋白等电点的测定第23页，课件共28页，创作于2023年2月（二）蛋白质沉淀实验1．蛋白质的盐析现象解释蛋白质溶液中加硫酸铵溶液加水上清液中加硫酸铵粉末加水第24页，课件共28页，创作于2023年2月2．重金属离子沉淀蛋白质

现

象解

释蛋白质溶液中加硝酸银

沉淀中加水

第25页，课件共28页，创作于2023年2月3．有机酸沉淀蛋白质

现

象解

释蛋白质溶液中加三氯乙酸

沉淀中加水

第26页，课件共28页，