液相色谱质谱HPLCMS联用-课件

AgilentLC-MS/MS64201内容1.LC-MS/MS的基本原理2.方法开发流程及优化3.电离影响因素与溶液化学4.注意事项2023/7/232液相色谱质谱HPLCMS联用精品资料1.LC-MS/MS的基本原理2023/7/234液相色谱质谱HPLCMS联用ESIionsource5液相色谱质谱HPLCMS联用2023/7/236液相色谱质谱HPLCMS联用Front-endionoptics2023/7/237液相色谱质谱HPLCMS联用Quadrupole2023/7/238液相色谱质谱HPLCMS联用CollisioncellHexapoleQuadrupole：ionfocusingOctopole：iontransmissionN20.5ml/min2023/7/239液相色谱质谱HPLCMS联用Rearquadrupoleanddetector2023/7/2310液相色谱质谱HPLCMS联用Pumpingsystem2torr10-210-310-5torrtorrtorr11液相色谱质谱HPLCMS联用2.LC/MS/MS方法开发流程1电离模式的选择2查阅文献，参考样品前处理的技术路线和色谱分离条件、质谱参数条件等。3MRM参数优化使用标准品优化fragmentor和collisionenergy4离子源参数的优化（源温度、流速）5LC分离方法的优化，1-3min为理想2023/7/2312液相色谱质谱HPLCMS联用MRM参数优化扫描（MS2Scan）2023/7/2313液相色谱质谱HPLCMS联用选择离子监测（SIM）优化毛细管出口电压（fragmentor），保证母离子的传输效率2023/7/2314液相色谱质谱HPLCMS联用子离子扫描（ProductIonScan）使用已优化好的fragmentor，选择定性定量离子，优化碰撞能量（collisionenergy），得到/优化子离子的响应，每个化合物一般选择两个强度最高的子离子，分别作定性离子与定量离子2023/7/2315液相色谱质谱HPLCMS联用多反应监测（MRM）使用已优化好的fragmentor和collisionenergy，优化Dwelltime2023/7/2316液相色谱质谱HPLCMS联用Dwelltime优化2023/7/2317液相色谱质谱HPLCMS联用Dwelltime优化2023/7/2318液相色谱质谱HPLCMS联用DynamicMRM标准MRM对多组分，出峰时间波动，灵敏度低。dMRM适合应用于多组分同时分析，自动优化分配DwellTime，兼顾灵敏度与数据采集质量！2023/7/2319液相色谱质谱HPLCMS联用thenumberofMRMsatanytimearemanyfewerthanwithtimesegmentmethods,allowingmuchfasterMScycletimes2023/7/2320液相色谱质谱HPLCMS联用3.电离影响因素与溶液化学溶液的化学性质

流动相

被分析物

基质的性质喷针内部针的位置针的状况雾化气压力高电压电极

毛细管和喷雾室电压设置

毛细管和喷雾室高压部件的状态绝缘体的状态21液相色谱质谱HPLCMS联用离子模式的选择正离子ES模式适合于碱性样品，amines，amides，aminoacids，antibiotics等酸性流动相负离子ES模式适合于酸性样品，acids，hydroxyls，含强负电性基团有杂原子，可失去质子。如COOH、OH中性偏碱性流动相可正可负比较灵敏度2023/7/2322液相色谱质谱HPLCMS联用溶剂匹配反相溶剂：甲醇、乙腈、水兼容液质的盐（常用）：甲酸、乙酸(0.01-1%)、甲酸铵、乙酸铵(小于20mM)慎用：三氟乙酸等不兼容盐

硼酸盐、硫酸盐、磷酸盐（不挥发或易形成离子对）2023/7/2323液相色谱质谱HPLCMS联用流动相中添加剂正离子模式-

甲酸、乙酸和三氟乙酸（慎用）负离子模式-氨水正离子＆负离子-甲酸铵或乙酸铵（不高于20mM）2023/7/2324液相色谱质谱HPLCMS联用电喷雾-离子对的形成对正离子检测，由于离子对的形成，是溶液或气相中的离子中和！[M+H]++A-[M+H+A]0

A=B,S,P有利于中性产物A=甲/乙酸盐有利于生成带电物质离子对强度：B,S,P＞三氟乙酸＞乙酸盐，甲酸盐2023/7/2325液相色谱质谱HPLCMS联用电喷雾-离子对的形成对负离子，由于离子对的生成，使溶液或气相中的离子中和！[M-H]-+C+[M-H+C]0

C=Na,K,Li有利于中性产物C=NH4+

有利于带电物质2023/7/2326液相色谱质谱HPLCMS联用ESI:离子竞争机制表面竞争被分析离子与电解质离子转换为气相离子的竞争使被分析物相应降低。电荷竞争OAc﹣+AH+→HOAc+A2023/7/2327液相色谱质谱HPLCMS联用4.注意事项使用0.22um孔隙滤膜过滤流动相含水＞50%,适当提高干燥气体的流速和温度选择母离子：准分子离子，[M+H]+、[M-H]-优先，避免选择加和离子[M+Na]+,所需能量较低，灵敏度好。子离子的选择：高质量端的特征离子。2023/7/2328液相色谱质谱HPLCMS联用气相离子的产生表面活性高（具低溶剂化能）的离子优先转移至雾滴表面，最终转变为气相离子--竞争机制应采用表面活性低的缓冲盐低浓度的挥发性的酸、碱及缓冲盐2023/7/2329液相色谱质谱HPLCMS联用小结：流动相的考虑金属离子缓冲盐影响离子化表面活性剂影响去溶剂化离子对试剂可以离子化，而导致高背景噪音强离子对试剂可与待测物反应，导致待测物不能离子化TEA干扰正离子模式(m/z102)TFA扰负离子模式(m/z113)增塑剂（邻苯二甲酸酯）背景干扰，(m/z149,315,391)2023/7/2330液相色谱质谱HPLCMS联用API质谱图的解释检测到的离子种类依赖于溶剂添加剂和分析所用的条件。正离子检测-[M+H]+

酸性条件-[M+Na]+

，[M+K]+-[M+NH4]+有铵盐缓冲盐-[M+X]+X=溶剂或缓冲溶液中的阳离子-[2M+H]+高浓度时形成的二聚体离子-[M+H+S]+溶剂加合离子负离子检测-[M-H]-碱性条件-[M+X]-X=溶剂或缓冲溶液中的阴离子-[M-H+S]-溶剂加合离子2023/7/2331液相色谱质谱HPLCMS联用名义分子量和平均分子量对于分子C6H3Cl3平均分子量为6(12.01115)+3(1.000797)+3(35.453)MW=181.4286(12.000)+3(1.00078)+3(34.9989)=179.9990精确质量/单同位素质量180.0daltons----名义分子量nominalm