已知基因序列的获取方法教学课件

口知基因序列的获取策略兼谈引物设计与序列分析黄钢第三军医大学遗传教研室2019.111获取序列信息,设计合适的引物选取相应的组织或细胞,提取RNA并RTRNaseh消化(可选)PCR扩增获得全长CDNA装入合适的克隆或表达载体,菌落PCR、酶切与测序证实根据需要进一步进行亚克隆、如何获取已知目的基因的序列信息■先査找其蛋白相关信息,了解该基因编码产物的基本情况与功能()进一步查找其核酸相关序列信息,常用数据库:Genebank、EBI、DDBT)解软)工D带助的SeadExPASyContactsEXPASyProteomicsServerTheEXPASy(ExpertProteinAnalysisSystem)proteomicssemeroftheSwissinsituteoBonformanics(SB)isdedicatedtothearalysiscfproeinsequences4cm时!b0peningMinotdanbfcadipnandchalacisnzdion(Aldente,Findkod,Ptpilam,Phang,plow.SWISS-MODELRepository-AutomaticalygereratedproteinmodeDNA?+saChs(BLAST.]Linkst'thermolecuarbooddatabasesImageMaster/Melanie-Sofwarefor2-DPAG-analysght-MassSPectrometryImaSwissShop.automatcallyobtain(oyemail,newseqenceenniesrelevanbulletinsSwiss-ProtdocumentsCross-referencesBI83077:AAA58390.1EMBL/GenBank/DDBSequence83072,A58390.1;JIME![EELM83073,AAA58390.1:JOINE!.[EMBLGenBank/DDBI]CoDingSequerM83074oDingsequenceBC042665:AAH42665.1enBank/DDbIR1DR9:10-JAN-01.LExPASyRCSB/EBI118L:04-APR-01.ExPASy/RCSB/EBI]etailedlistoflinkedstructurCD80HGNC:1700:CD8dsCDsoenelynxCD80:Homosapiens.MIM12203[BI!EI]、目的基因CDNA序列的获取方法CDNA文库扫描RT-PCR人工合成组织RNA的提取在匀浆器中加工冷冻的组织通过注射器加工冷冻的组织在液氮中将组织研磨成粉末在液氮中研磨组织至粉末状,细胞裂解更完全,产量比前二者多一倍合适的RNA提取方法加上合适的组织处理方法,才能够获得最佳的提取效果RNA提取两要素■忌讳贪多:不能指望1mltrizol提取100mg以上组织,一般50mg用1mITrizol较合适■速战速决:尽量缩短提取时间,不要完全照搬Protoco,比如匀浆后如果没有很多组织碎片的话,可以立即加入氯仿,立即离心,140000m离心10min,取完上清加入0.6~1体积的异丙醇,立即高速离心(14,000rpm,5min),……总之尽量快速!尽量减少RNAase污染■RNase的危害主要集中在将RNApellet溶解在水中之后,防止RNA降解的重点应当放在组织样本的保存和RNA水溶液的保存上。■注意实验前的准备工作:各种器材的去RNAase处理与无RNAase的准备。长期保存RNA