特殊染色技术-核酸染色法（病理检验技术课件）

病理检验技术

特殊染色核酸-概述

核酸

核酸(

nucleic

acid)是细胞遗传物质的基本化学物质,一切细胞代谢过程都需要有核酸参加。它在生物的个体发育生长、繁殖、遗传和变异等生命过程中起着极为重要的作用。

核酸是高分子聚合物，它的基本单位是核苷酸,是由上百个甚至几千万个核苷酸聚合而成的长链,这种长链又称多核苷酸。核苷酸是由磷酸和核苷所组成,核苷又由戊糖和碱基组成。根据核酸的生物功能和化学结构,把核酸可分为以下两类:一类是核糖核酸(

ribonucleie

acid),简称RNA；另一类是脱氧核糖核酸(

deoxyribonucleic

acid),简称DNA,这两类核酸在生物细胞内一般都与蛋白质结合形成核蛋白。核酸

核酸

核酸的组成

脱氧核糖核酸是由两条单核苷酸链以碱基配对原则(A/T,C/G)通过碱基间的氢键结合双螺旋结构;核糖核酸则是一条单核苷酸链以碱基配对原则(A/U,C/G)通过碱基间的氢键结合,折叠成立体结构。核酸

核酸在细胞内的分布,核糖核酸主要存在于胞质内(胞质约占90%,核仁约占10%),脱氧核糖核酸主要存在于胞核内(胞核约占99%,胞质线粒体约占1%)。组织越富于细胞,极酸的含量也就越多,例如肝,脾、淋巴结和胰腺等组织核酸含量很多,反之如肌肉、脑等组织核酸含量很少。核酸

核酸

显示核酸的方法有多种，最常用的如:Feulgen酸水解-无色品红法显示脱氧核糖核酸，甲基绿派洛宁法显示核糖核酸和脱氧核糖核酸，其他方法：如培花青-铬矾法等。病理检验技术

特殊染色核酸-染色

一、酸水解-无色品红法(根据

Feulgen和

Rossenbeck)

(一)试剂配制1.0.5%的火棉胶液：火棉胶片0.5g、无水乙醇50ml、乙醚50ml先把乙醇与乙醚混合,再加入火棉胶片放置1天,期间轻摇数次,使其充分溶解2.lmol/L盐酸3.无色品红液：碱性品红1g、蒸馏水200ml、1mol/L盐酸20ml、偏重亚硫酸钠1-1.5g、活性炭2g4.0.5%的偏重亚硫酸钠5.0.1%的固绿一、酸水解-无色品红法

无色品红液配制方法:（1）取一个洁净的500ml三角烧瓶盛蒸馏水200ml,在电炉上煮沸后取出。（2）加入碱性品红1g于煮沸后的蒸馏水内,轻轻摇动数分钟使碱性品红彻底溶解,此时溶液为深红色。（3）待冷却至约50℃时,过滤至另一个洁净三角烧瓶内.（4）加入1mol/L盐酸20ml,稍摇动使混匀.（5）再待冷至25℃左右,加入偏重亚硫酸钠,用塞塞紧,并稍摇动使其溶解,这时碱性的品红的颜色开始变淡.（6）置于暗处约24小时,此时溶液应呈淡红色或淡稻草黄色。（7）加入活性炭2g,轻轻摇动1-2分钟后静置1小时,用双层滤纸再过滤到另一个棕色小口砂塞内,此时溶液应完全无色,故称无色品红,又称

Schift试剂.（8）置4℃的冰箱保存持用,用前取出恢复至室温.一、酸水解-无色品红法

(二)染色步骤1.组织用

Camoy液固定2~6小时,经95%的乙醇开始脱水包埋。2.切片厚5μm,常规脱蜡至无水乙醇。3.新的无水乙醇浸洗2次,每次1分钟。4.切片转入0.5%的火棉胶浸1分钟,取出后稍晾干。5.80%的乙醇10分钟。6.蒸馏水稍洗。7.室温1mol/L盐酸稍洗。8.预热至60℃的1mol/L盐酸在60℃水浴中水解8分钟。9.室温1mol/L盐酸稍洗。10.蒸馏水稍洗。一、酸水解-无色品红法

(二)染色步骤11.无色品红液(加盖)于室温下置暗处作用60~90分钟。12.不经水洗,直接滴入0.5%的偏重亚硫酸钠浸洗2次,每次2分钟。13.流水冲洗5分钟。14.0.1%的固绿复染1秒。15.稍水洗。常规脱水透明，中性树胶封固。16.常规脱水透明，中性树胶封固。一、酸水解-无色品红法

（三）结果脱氧核糖核酸(DNA）呈红紫色,胞质和其他成分呈淡绿色。一、酸水解-无色品红法

(四)对照方法1.取另一连续切片同时操作至第6步蒸馏水洗后,用蒸馏水代替第8步的1mol/L盐酸水解后入无色品红作用液,以后步骤相同。2.另一连续切片于脱蜡后,先用脱氧核糖核酸酶(

deoxyribonuclease)lmg/ml,于37℃的温箱内消化2小时,再按上法开始进行染色。经上述方法之一处理后的切片,染色应为阴性。

一、酸水解-无色品红法

(五)注意事项1.一般固定剂都适用于这一反应,但用

Bouin固定的组织,会引起过度水解,故不宜采用。2.脱蜡后切片入火棉胶液处理,目的是防止切片在60℃的1mol/L盐酸水解过程中脱落,如切片粘贴牢固,第3~5步可省去。3.在60℃的1mol/L盐酸水解前后均经1次室温的1mol/L盐酸稍洗，,目的是使组织不因骤变太大而松脱。4.如染片用作显微分光光度计定量,应省去固绿复染。5.置于1mol/l盐酸水解时的温度很重要,以60℃为合适,水解时间视所用的固定液而不同,水解时间不足或过长都会影响染色效果。

一、酸水解-无色品红法

置于60℃1mol/L盐酸水解时间固定液所需水解时间（分钟）固定液所需水解时间（分钟）Carnoy8Zenker510%甲醛8Helly8FAA7Bouin不宜(六)染色机制脱氧核糖核酸通过用盐酸水解,第一步是从DNA上的脱氧核糖核酸残基分解出碱基,第二步是在脱氧核糖残基的第1~4位碳键处打断糖苷键而游离出醛基,后者与无色品红液形成红紫色的复合物把DNA显示出来。(七)应用脱氧核糖核酸是染色体的主要化学成分,在细胞增生的病变中(肿瘤、肉芽组织)、核肥大和核深染,是由于DNA合成增加,酸水解-无色品红法染色可清晰地显示DNA的量及其分布(如聚集于核膜、核仁四周及散在核内)。一、酸水解-无色品红法

二、甲基绿派洛宁法(改良Cook)（一）试剂配制1.0.2mol/L醋酸盐缓冲液(pH4.8)2.2%的甲基绿水溶液：甲基绿2g、蒸馏水100ml3.1%的派洛宁G4.甲基绿派洛宁染液：2%的甲基绿(已提纯)5ml、1%的派洛宁G5ml、蒸馏水10ml、0.2mol/L的醋酸盐缓冲液(pH4.8)16ml依次混合,轻轻摇动使完全溶解后,置4℃的冰箱保存5.正丁醇二、甲基绿派洛宁法(改良Cook)（二）染色步骤1.组织固定于

Carnoy液3-5小时,经95%的乙醇开始脱水包理。2.切片厚5μm,常现脱蜡至水,蒸馏水再稍洗。3.甲基绿派洛宁染液于室温浸染50-60分钟4.取出切片,用滤纸抹干切片周围染液5.正丁醇浸洗3次,每次2~3分钟6.二甲苯透明,中性树胶封固。二、甲基绿派洛宁法(改良Cook)(三)结果存在于胞质和核仁内的核糖核酸呈红紫色,胞核染色质内的脱氧核糖核酸呈绿色或蓝绿色。浆细胞胞质也呈较深的红紫色。二、甲基绿派洛宁法(改良Cook)(四)对照方法取另一连续切片用核糖核酸酶(ribonuclease)lmg/ml于37℃的温箱内消化3小时,蒸馏水洗后置入甲基绿派洛宁染液内染色，结果核糖核酸为阴性。切片在10%的高氯酸(perchloricacid)于4℃处理12~18小时,水洗后用1%的碳酸的水溶液中和2分钟,流水冲洗5分钟,再用蒸馏水洗后置入甲基绿派洛宁染液内染色,结果核糖核酸应为阴性。二、甲基绿派洛宁法(改良Cook)(六)染色机制对此法的染色机制,目前了解得还不够清楚,一般可从以下两方面理解1.电离作用脱氧核糖核酸和核糖核酸都既有磷酸基,又有碱基,故为两性电解质。在一定的条件下,可以电离而带电荷,因此,都有一定的等电点。甲基绿和派洛宁在水中电离后,都产生带阳电荷的离子。甲基绿电离后,在五价氮处产生两个正电荷,碱性较强。派洛宁电离后仅产生一个正电荷,碱性较甲基绿弱,在染色时两者进行竞争,碱性较强的甲基绿就与胞核(等电点pH3.8-4.2)进行极性吸着而结合,碱性较弱的派洛宁与胞质(等电点phH4.6~5.2)吸附结合。2.聚合作用甲基绿着染脱氧核糖核酸呈绿色,派洛宁着染核糖核酸呈红色,这不是反映两种核酸间在化学上的不同,而是反映两种核酸的聚合状态。甲基绿与聚合高的脱氧核糖核酸有亲和力而结合,派洛宁易与聚合低的核糖核酸