分子生物学研究方法

分子生物学研究方法2023/7/222本章将在回顾重组DNA技术史上主要事件的基础上，讨论DNA操作技术、基因克隆的常用载体系统以及基因的分离与鉴定等环节。DNA分子的切割与连接核酸分子杂交凝胶电泳细胞转化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定点突变PCR扩增等核心技术2023/7/2235.1重组DNA发展史-------三大成就

：1.40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；1928FrederickGriffith&1944OswaldAveryTransformationofStreptococcuspneumoniae(肺炎链球菌)1957年，HeinzFraenkel-Conrat和B.Singre的杂合病毒实验1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA侵染细菌实验2023/7/2242.50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；X-raysourceCrystallizedDNARosalindFranklinMauriceWilkinsPhotographicfilm1953-Franklin&Wilkins2023/7/225

1920年7月25日，罗莎琳生于伦敦的一个犹太家庭。1942年，她又到英国煤炭应用研究协会从事碳纤维研究。1951年，伦敦大学国王学院（KingsCollege）的约翰•伯纳尔（JohnRandall）邀请罗莎琳到他那里工作。他的一位研究生对DNA分子作了初步的X衍射试验，伯纳尔希望她对实验结果进行深入分析。

1952年，罗莎琳得到了B型DNA分子清晰的X衍射图像（DNAPhotograph51），这是一张具有里程碑意义的图像。1953年1月，威尔金斯把这张图片展示给了沃森和克里克。

1962年，沃森、克里克和威尔金斯分享了诺贝尔生理学奖，然而他们在获奖后的演讲中也没有提到罗莎琳。1958年4月，罗莎琳被病魔夺去了年仅38岁的生命。

2023/7/2263.50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。JacobandMonod2023/7/227两大技术保证：1.DNA的体外切割和连接1962年Arber发现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了DNA连接酶DNAligasecovalentlylinkstwoDNAstrandsRestrictionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase3’5’3’5’但是，如果没有分离和富集单一DNA分子的技术，科学家就无法对这类物质进行直接的生化分析。2023/7/2281972-PaulBerg,ProducedfirstrecombinantDNAusingEcoRIEcoRIrecognitionsitesλphageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNA2023/7/229几百碱基对长短的DNA片段适于进行精细的物理图谱以及DNA序列分析等；因此常选用切点较多的识别位点为4个核苷酸序列的酶。这在建立基因组文库常用的方法识别位点为6个核苷酸序列的限制性内切酶通常产生1一10kB长短的限制性寸段，适于进行较长的DNA分子的物理图谱和包括内含子．结构基因以及调控序列在内的完整基因的克隆；2023/7/2210重组DNA实验中常见的主要工具酶酶

类功

能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶I（大肠杆菌）按5'到3'方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记实验或用来进行DNA的连接末端转移酶在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶III从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸λ噬菌体DNA外切酶从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团

到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。2023/7/2211DNA片段在体外不具备自我复制能力，要想得到足够量和足够纯度的DNA，必须将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。这就是基因克隆，或分子克隆。2023/7/2212从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒DNA。2023/7/22131973-Boyer,Cohen&ChangTransformE.coliwithrecombinantplasmidStanleyCohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycinresistancegenePlasmidpSC101TetracyclineresistancegeneE.colitransformedwithrecombinantplasmidTransformedcellsplatedontomediumwithkanamycinandtetracyclineOnlycellswithrecombinantplasmidsurvivetoproducecoloniesBoyer-Cohen实验：1973年斯坦福大学的S.Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。2023/7/2214Generalprocessofgeneengineering(1).

从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。(2).

将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。(3).

将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。(4).

从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。2023/7/2215(5).将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能之间的关系。生长分化刺激因子基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力。2023/7/22162.DNA的核苷酸序列分析技术

DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发站起来的一门重要的DNA技术学，这门技术，对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆DNA片断的操作方面，都有着十分广泛的使用价值。1968年华裔科学家吴瑞设计出引物延伸测序策略Sanger在它的基础之上发展了快数测定DNA的末端终止法2023/7/2217Sanger双脱氧链终止法(dideoxy-terminationsequencing)

原理：双脱氧（2'，3'）-核苷酸可以象2'-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因3’端不具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列。不能和下一个核苷酸通过磷酸二酯键连接起来2023/7/2218AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG5’3’添加DNApolymerase所有4dNTPs其中一种标记的ddNTPddTTPddCTPddGTPddATP在四个不同的反应管中各只包含一种ddNTP.2023/7/2219AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG5’3’TTCGATTCGATTTCGATTTTCTCGATTTCTCGATTTCCTCGTCGATreactionCreactionGreactionAreaction每一管中的复制的序列都停留在ddNTPs处5’2023/7/2220反应终止后，四个反应管中的反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离.这四个反应管中延伸的寡核苷酸仅相差一个碱基.电泳结构通过显色指示.

TCG

A3’CCTTTAGCT5’2023/7/2221

过程：制备ss-DNA→与引物退火→分为4个反应系统→每个系统中加入dNTP（其中dATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸→DNA聚合酶定序反应→反应产物变性后电泳→凝胶干燥→放射自显影。`

该法亦适合mRNA的序列分析。

GC富集区常出现“隐影”或“停止”现象，如在反应中加入dITP（脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸-7-脱氧鸟苷可解决GC富集区的测序。2023/7/2222b．Maxam-Gilbert化学修饰法(哈佛大学)

该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。该反应的关键在于使DNA的4种核苷酸中，只有1-2种发生特异性的化学切割反应：

碱基的特异性修饰；

被修饰的碱基从核糖环上转移；

失去碱基的糖环部位发生DNA链断裂。2023/7/22232023/7/2224DNA定序的一般程序

酶法测序(Sanger)

化学测序法(Maxam-Gilbert)

待测DNA片段待测DNA片段

↓

↓次克隆5’-末端标记

↓筛选重组子链分离限制酶切

↓模板增殖与纯化↓

↓纯化标记的ss-DNA

与引物退火↓

↓定序反应定序反应

↓聚丙烯酰胺凝胶电泳

↓真空干燥

↓放射自显影

↓阅读序列和计算机录入

↓核苷酸序列的分析与比较2023/7/22252023/7/2226DNA序列测定的自动化

1.DNA测序步骤与自动化1）模板制备可自动化2）定序反应可自动化3）凝胶电泳自动化有一定困难：制胶，点样，电泳，凝胶干燥，放射自显影。4）核苷酸序列阅读与计算机输入可自动化2.自动测序仪

Conney等人于1987年设计了不同荧光染料标记引物，然后做链终止测序，用激光扫描阅读序列。

红色引物+T反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP）

黄色引物+G反应系统（引物+DNA+dNTP+ddGTP）

绿色引物+A反应系统（引物+DNA+dNTP+ddATP）

兰色引物+C反应系统（引物+DNA+dNTP+ddCTP）2023/7/2227优点：i.四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间；

ii.可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影；

iii.可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。缺点：无法保留原始记录,四个反应产物点在一条道上,相互间会发生干扰,导致读序时分辨率下降。DNA序列分析自动化包括两个方面的内容，一是指“分析反应”的自动化，另一方面则是指“读片过程”的自动化。2023/7/22282023/7/2229杂交测序自从70年代末期DNA测序技术问世以来，人们已经做了大量重要的改进，但从根本原理上创新的则只有杂交测序法（sequencingbyhybridization，SBH）一种。它利用一组已知序列的寡核苷酸短序列作探针，同某一特定的较长的靶DNA分子进行杂交，从而测定其核苷酸的序列。

DNA杂交测序实质上包括两个主要的步骤首先是将待测定的靶DNA分子同一组已知其核苷酸顺序的寡核苷酸探针进行杂交，然后与那些能够同靶DNA形成完全的双链杂合分子的寡核苷酸探针做比较分析，并据此推算出靶DNA的核苷酸序列。2023/7/2230如果将一种核苷酸顺序为5'-AGCCTAGCTGAA-3'的12-mer的靶DNA，与一组完全随机的8-mer寡核苷酸探针混合杂交，在总数为48=65536种的8-mer探针群体中，仅有5种会与靶DNA形成完全互补的双链体分子。根据这5种发生了完全杂交作用的8-mer寡核苷酸探针之间的重叠序列的线性关系，便可推算出这段12-mer的靶DNA分子的核苷酸顺序。

当然，这只是一种理想化状态，实际上此种杂交模式要复杂得多，因为那些没有同靶DNA片段完全互补的寡核苷酸探针，也仍然会与之形成不稳定的双链分子。2023/7/2231（基因芯片测序)2023/7/2232上图是两条长度均为17-mer的靶DNA片段I和II的杂交测序结果，两者仅在第8位碱基有不同，分别为C和T。靶DNA片段I可与1~8共8段彼此相互重叠的8-mer寡核苷酸形成完全的双链分子，但不能与第9段8-mer寡核苷酸形成完全的双链分子。根据相邻的两段8-mer寡核苷酸之间各自具有7个碱基的重叠情况，可以构建出互补的DNA序列。靶DNA片段II的杂交结果表明，横跨其第8位碱基T的6段8-mer寡核苷酸的双链体，由于含有内部的碱基错配，因此其杂交效率明显下降；但与第1和第8两段8-mer寡聚体形成的具有末端G-T错配的双链分子，其稳定性下降并不显著。与第9段8-mer寡核苷酸能杂交形成完全的双链体分子，证实与片段I相比，它在第8位发生了由C碱基到T碱基的变化。5.2

DNA操作技术

5.2.1核酸的凝胶电泳自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。

2023/7/22345.2.1.1基本原理

长度不同的核酸分子也具有几乎一致的电荷-质量比。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。如果只在溶液中则不能分离，如果改在凝胶中，则分离得以实现。由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等，故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。已知摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数，因此，根据分子大小的不同、构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。2023/7/2235聚丙烯酰胺凝胶电泳常用于蛋白质及小分子量核酸的分离。DNA的序列分析就采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于测定蛋白质的分子量。相邻的SDS分子由于带有相同的负电荷而相互排斥，使结合了SDS分子的蛋白质形成棒状构型并且具有相同的荷质比，此时的蛋白质处于变性状态。它们在凝胶中的迁移速度决定于它们的长度。脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)是近年来发展起来的分离大分子量DNA的有效手段。在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。反之，较小的DNA移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。2023/7/22362023/7/2237琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间2023/7/2238聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间2023/7/2239凝胶类型及浓度分离DNA片段的大小范围（bp）0.3%琼脂糖50000~10000.7%琼脂糖20000~10001.4%琼脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。2023/7/2240在凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭（ethidiumbromide，简称EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，可十分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。在紫外线的照射下结合溴化乙锭的DNA分子发出荧光2023/7/2241称样溶解加热制板倒胶电泳操作基本程序2023/7/2242取样点样电泳检测2023/7/22431.将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。

所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。处于能够接受外源DNA状态的细胞称为感受态细胞。5.2.2细菌转化步骤：2023/7/22442.与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。3.立即将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。4.在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性恢复5.涂布于选择性培养基中分离转化子。2023/7/2245其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。2023/7/22465.2.3基因扩增聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。DNA聚合酶具有在核苷酸底物的存在下，以一条DNA链为模板催化新链的合成需要具有3’-OH的引物具有5’到3’方向聚合的能力通常具有3’到5’外切酶活性2023/7/2247PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95oC)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意图①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2023/7/2248PCRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；2023/7/2249PCRCycle-Step3-

At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链。2023/7/2250Endofthe1stPCRCycle–

ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。2023/7/2251TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon2023/7/2252PCR仪2023/7/22535.2.4实时定量PCR

SYBRGreenI与dsDNA结合荧光信号会增强800-1000倍，用SYBRGreenI染色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低。可适用于多种电泳分析。

2023/7/2254反向PCR(reversePCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究.

反向PCR(reversePCR)2023/7/2255(1)、任一DNA序列在文库中出现的概率：

N:该序列需要克隆的总数；p:待克隆DNA序列在文库中设定的出现概率，一般为99％；I：待克隆DNA片段的长度，假定为17kb;G:基因组DNA的总长度，如人类为3×109bp5.2.5基因组文库5.2.5.1文库大小2023/7/2256将数据代入上式

=8.1×105N的含义是克隆大小为17kb的人类DNA时，所构建的基因文库数必须在8.1×105以上时，才能以99％的概率得到此克隆。2023/7/2257(2)、建库的目的：1）.从复杂的基因组中分离单拷贝的基因；2）.是从来源复杂的总mRNA的cDNA文库中分离稀有的cDNA克隆。(3)、建库的关键：如何产生足够数量的重组DNA(4)、建库应注意：

1）.保证载体DNA和靶DNA均不被外源DNA序列污染；2）.尽可能用“电话克隆”。2023/7/22582023/7/22595.2.5.2

DNA克隆片段的产生与分离（一）、基因组DNA的片段化

(1).用限制酶片段化:用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部离,直接和载体连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-ganapproach)存在的问题：

①所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段的混合群体。以每个载体可插入1～3kbDNA计算，基因库至少含10～30万个重组质粒。从中筛出目的基因工作量是很大的。②目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个基因分载在几个重组质粒上，完整筛出更不容易。2023/7/2260(2).随机片段化：超声波：可产生300bp的短片段。高速搅拌：1500转/分×30分可切平均长度8kb的分子群体。(3).双酶消化

双酶切产生的DNA片段平均大小不超过1kb,但如采用双酶部分消化，产物的分子量可达10～30kb,它们存在着随机序重叠，用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可将这些片段群体按大小分开，可得到的分子量大小约为20kb的随机DNA片段群体。2023/7/22615.3RNA基本操作技术由于mRNA分子敏感脆弱，在自然状态下难以被扩增。一般将其反转录成稳定的DNA双螺旋，再插入到可以自我复制的载体中。cDNA来自反转录的mRNA，不含冗余序列，通过特异性探针筛选cDNA文库，可以较快地分离到相关基因，2023/7/22625.3.1总RNA的提取要获得均一的RNA取决于能否有效去除RNA提取中DNA和蛋白质。采用高活性RNA酶抑制剂，可以防止RNA的降解，采用酚-氯仿抽提可以方便地去除RNA提取物中蛋白质。常用的异硫氰酸胍（Trizol试剂异硫氰酸胍和苯酚）和盐酸胍是RNA抑制剂之一，它能在裂解细胞的同时使RNA酶失活，而且还能使RNA提取过程中的蛋白质变性。

2023/7/22632023/7/22642023/7/2265

5.3.2.mRNA的纯化

可应用PromegaPolyATtractmRNA分离系统分离多聚(A)mRNA。将用生物素标记的寡聚(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA。Promega公司mRNA磁珠法分离试剂盒(PolyATtractmRNAIsolationSystems)2023/7/22665.3.3反转录生成cDNA

可同时在反转录系统中加入寡聚（dT）及随机引物R6，以保证得到全长cDNA，应选用活性较高的反转录酶及甲基化dCTP，保证所获得双链cDNA的方向性。

因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5‘-methylC的外源DNA，所以实验中常选用mcrA-mcrB-菌株。

由于cDNA第一链中含有5’甲基化的dCTP，使在以后的实验步骤中可以避免被限制性内切酶所消化。

merA(Modifiedcytosinerestrictionproteina)这种酶能特异性地作用于外来DNA上的被甲基化的胞嘧啶序列，及C5mCGG特异序列。merB,C(Methylcytosine-specificrestriction)识别G5mC.2023/7/2267

Oligo（dT）引物一般包含10～20个脱氧胸腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的引物共同组成，随机引物一般是包含6～10个碱基的寡核苷酸短片段。

在第一链cDNA合成后直接采用末端转移酶（TdT）在第一链cDNA的3'-端加上一段Poly（dC）的尾巴，同时进行酶切创造出另一端的粘端，与片段Ⅱ一起形成环化体，这种环化了的杂合双链在RNA酶H、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ和DNA连接酶的作用下合成与载体联系在一起的双链cDNA。其主要特点是合成全长cDNA的比例较高，但操作比较复杂，形成的cDNA克隆中都带有一段Poly（dC）/（dA），对重组子的复制和测序都不利。2023/7/2268自身引导法（图8-3）：

首先用氢氧化钠消化杂合双链中的mRNA链，解离的第一链cDNA的3'-末端就会形成一个发夹环（发夹环的产生是第一链cDNA合成时的特性，原因至今未知，据推测可能是由帽子的特殊结构相关），并引导DNA聚合酶复制出第二链，此时形成的双链之间是连接在一起的，再利用S1核酸酶将连接处（仅该位点处为单链结构）切断形成平端结构可以进行连接。

2023/7/2269OligodT或随机引物

合成cDNA第一链合成cDNA第二链补平cDNA链末端强碱2023/7/2270从表中看出低丰度mRNA，每个细胞仅有14个拷贝左右，其总量约占总mRNA的30%，其中约有11,000个左右的不同种类的mRNA。因此，为了获得一个能够代表全部低丰度mRNA序列的cDNA基因文库，必须的最低克隆数（理论值）应是11,000/0.30=~37000。但由于在实验中存在着取样上的差异，有些序列容易被克隆，有些序列却不容易被克隆，为了保证基因文库中能够包含所有的序列，就必须增加克隆的数目。为了使上述低丰度mRNA的cDNA克隆达到99%的期望率，大约需要筛选170,000个克隆。丰

度

等

级相应丰度等级的mRNA群体占总mRNA的百分数（%）在相应丰度等级中所含的不同种类mRNA序列的数量（个）每个细胞所含的相应丰度mRNA序列的拷贝数（个）高丰度22303,500中丰度491,090230低丰度2910,670142023/7/22715.3.4cDNA文库概况:cDNA文库是通过反转录mRNA，并制备双链cDNA(doublestrandedcDNA)来构建的。构建cDNA文库的策略是取决于：(1)目的mRNA的相对丰度；(2)筛选方法：除简单的分子杂交法外还可对表达产物用各种方法进行鉴定。2023/7/2272

CDNA文库的优点(1).使遗传物质为RNA病毒可建立文库；(2).因克隆数比基因组文库少得多，易于筛选；(3).从分化特异的细胞的cDNA文库中可分离到特异表达的基因。(4).建库时已排除了其它的RNA，使假阳性率减低。(5).

cDNA文库可在细菌中表达，可用多种策略进行筛选。2023/7/2273但应注意：1).细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的mRNA要求很高的克隆数(要用公式来计算)。2).有的基因表达具有严格的时空性，要获得其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或不同组织细胞中的mRNA制备的cDNA文库会包含一些共同和特异序列。这可用于分离差异表达的基因。3).cDNA文库的DNA无内含子、调节元件和基因间DNA。不能用于基因结构和调节的研究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部分重叠的cDNA克隆。2023/7/2274第三节RNA操作技术5.基因文库的筛选基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。筛选方法有很多种，常用的有：核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法2023/7/2275原位杂交技术两种意义的原位杂交;一种是指在构建基因组文库或cDNA文库时，长在培养皿上的菌落或噬菌斑经转移到硝酸纤维膜上后进行分子杂交。另一种原位杂交技术则是指在细胞、组织切片上直接进行分子杂交。通过检测细胞内特异mRNA的存在与否，它能够告诉我们，在哪些细胞中有特异基因的表达。2023/7/22762023/7/2277InsituhybridizationLocalizationofDNALocalizationofRNA

2023/7/2278底物碱性磷酸酶链霉抗生物素硝酸纤维滤膜2023/7/22795.4SNP的理论与应用SNPs的定义：单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。2023/7/2280位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单倍型，相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代。2023/7/2281SNPs的研究意义（1）.SNPs作为第三代遗传标记（已知性、可遗传性、可检测性），用于疾病基因的定位、克隆和鉴定。___路标的作用传统研究策略（表征、蛋白、基因）逆向遗传学（表型、基因、蛋白），（2）.基因多态性研究研究SNPs本身对机体的影响（生理特征、病理条件下的千差万别）

第1代标记限制性片段长度多态性（RFLP），第2代标记

1985年，小卫星中心、可变串联重复VNTR可提供不同长度的片段，其重复单位长度为6至12个核苷酸，1989年微卫星标记系统2023/7/2282SNPs研究进展和方向（1）.SNPs数据库的构建发现（2）.SNPs功能的研究（在1的基础上）2023/7/2283SNPs检测方法（1）.理想的检测SNPs的方法

——发现未知的SNPs，或检测已知的SNPs1)灵敏度和准确度的要求（反应原理严紧）2)快速、简便、高通量(操作和分析的自动化程度高）3)费用相对低廉（2）.现状：到现在还没有一个符合以上条件的理想方法出现,但根据实际情况,可以选择出较合适方法。2023/7/2284SNPs检测方法的分类一、区分SNPs位点的方法

1.基于杂交的方法2.基于酶的方法3.以构象为基础的方法4.直接测序的方法二、检测分析技术

1.凝胶分析技术2.荧光检测技术3.DNA芯片4.质谱检测技术2023/7/2285SNP的检测技术（1）.基因芯片技术通过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互补的序列杂交而不与含有单个错配碱基的序列杂交。优点是高通量，缺点是成本高。（2）Taqman技术2023/7/2286Taqman法该技术的基本原理是利用Taq酶的5′核酸外切酶活性,在这个PCR反应中除了两个传统的PCR引物P1、P2外,还有第三个引物P3即等位特异性Taqman探针,含有待检测的SNP位点,特异结合在P1结合位点的下游。Taq酶以P1为引物合成新的DNA链,随着反应的进行Taq酶接触到P3并激发其5′→3′外切酶活性,使P3从5′端开始降解,最后DNA链得以延伸而P3探针上的荧光基团和猝灭基团由于不再在一个分子上了,荧光基团释放荧光信号。荧光信号的强弱与PCR产物的数量成比例。这种检测方法的优点是闭管进行,因而减少了PCR污染的风险,但探针标记的成本较高,且因其采用荧光猝灭及双末端标记技术,猝灭难以彻底,本底较高。

2023/7/2287分子信标（Molecularbeacons）分子信标是一种新型的发卡结构的寡核苷酸探针,是在样品PCR过程中因和样品DNA杂交后而使自身荧光构象改变从而实现对SNP的检测(原理见图1)。分子信标由称为“茎”(stem)和“环”(loop)的两部分构成,环的序列和待扩增的目的片段互补并含有要检测的SNP位点。当分子信标和其完全互补的目的片段杂交时,其发卡结构被拉开而使荧光分子和荧光猝灭基团在空间上分开从而发射出荧光,其信号可提高900倍。2023/7/22881.

1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物（包括DNAPolymerase、ATPSulfurylase、Luciferase和Apyrase腺苷三磷酸双磷酸酶）和底物混合物（包括5’-磷酰硫酸APS和Luciferin）。2.四种dNTP（dATPS脱氧腺苷硫代三磷酸

，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模板配对，与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。3.在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP;在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。4.反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。5.加入另一种dNTP,使第2-4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。dATPS不是荧光素的底物焦磷酸测序法(Pyrosequencing)2023/7/2289DNA聚合酶、ATP硫酸化酶(ATPsulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase)5’-磷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfat，APS)、2023/7/22905.5基因克隆技术5.5.1RACE技术（rapidamplificationofcDNAends）5.5.2.应用cDNA差示分析法克隆基因5.5.3.Gateway大规模克隆技术5.5.4基因的图位克隆法2023/7/22915.5.1RACE技术（rapidamplificationofcDNAends）

是用于从已知cDNA片段扩增全长基因的方法，它根据已知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列。用于扩增5’端的方法称为5’RACE，用于扩增3’端的称为3’RACE。已知序列cDNA的来源序列表达标签减法cDNA库差式显示基因文库筛选获得高质量总RNA去磷酸化去掉mRNA5′帽子结构加特异性RNA寡聚接头合成第一条cDNA链5′RACE3′RACE将纯化后的PCR产物克隆到载体DNA中，进行序列分析RACE主要操作方法2023/7/22935’RACE在反转录酶的作用下，以已知基因片段内部。特异性引物启始cDNA第一条链的合成RNase混合物降解模板mRNA，纯化cDNA第一条链。

用末端转移酶在cDNA链3‘端加入连续的dCTP

以连有oligo(dG)的锚定引物和基因片段内部特异的nested引物进行PCR扩增，以期得到目的片段，并可用nestPCR进行检测。套式引物（NestedPrimer）PCR用第一套引物扩增15～30个循环，再用扩增DNA片段内设定的第二套引物扩增15～30个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增，而次级结构却很少扩增。用起始引物限量方法或Centricon30(Amicon)分子滤过器离心，在第二套引物加入前去除第一引物。（universaladaptorprimer，UAP）2023/7/22943’RACE是在反转录酶的作用下，以连有可以和polyA配对的oligo(dT)的锚定引物启始cDNA第一条链的合成。用RNaseH降解模板mRNA。用通用锚定引物和基因片段内部特异引物进行PCR扩增得到目的3‘片段，并可用nestPCR的方法继续进行检测和扩增。2023/7/22955.5.2.

应用cDNA差示分析法克隆基因

(1)应用mRNA差别显示技术分离克隆目的基因根据表达特性的差异可将高等真核生物的基因分为两大类：一类叫做看家基因（house-keepinggene），另一类叫做发育调控基因（developmentalregulatedgene。我们将不同基因在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的按时间、空间进行有序表达的方式称为基因的差别表达（differentialexpression）。1992年，美国波士顿Dena-Farber癌症研究所的两位科学家P.Liang和A.D.Pardee发明了一种叫做mRNA差别显示PCR（mRNAdifferentialdisplay）技术，简称DDRT-PCR。2023/7/2296DDRT-PCR的主要操作步骤如下：（1）从不同发育阶段或不同基因型的细胞群体中分离mRNA，并以3'锚定引物作为反转录的引物，合成第一键cDNA；

（2）用5'随机引物和某个3'端锚定引物对扩增第一链(掺入32P-dNTP)；LiangP和PardeeA根据PolyA序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物，其通式为5'-T11MN；同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种2023/7/2297（3）用DNA变性测序胶分离扩增产物，X光片曝光后检测差别条带；

（4）回收特异性差别条带；

（5）用同一引物对扩增已回收的DNA条带；

（6）用Northern，Southern及测序法分析所得的条带；

（7）以该DNA片段做探针，筛选全长cDNA或核基因。2023/7/2298(2)应用cDNA差示分析法（RDA）克隆基因l）cDNA文库差示筛选法，这是一种直接分离组织或发育特异表达基因的方法，例如对于两种不同的组织细胞，先提取它们的poly(A)+mRNA，分别构建这两种组织的cDNA文库，然后以这些mRNA为模板，合成放射性标记的cDNA探针，再用这两种探针分别与一类cDNA文库的两套重复考贝杂交，跟两种探针都杂交的克隆是两种组织细胞中都表达的基因，而仅与一种探针杂交的克隆则是在一种组织细胞中特异表达的mRNA，再对这样的克隆进行测序比较和鉴定，就可分离到这种组织特异表达的基因。用这种方法已分离到许多根茎叶和生殖器官等特异表达的基因。2023/7/2299A.差式杂交或扣除杂交克隆技术2023/7/22100

RDA法充分发挥了PCR以指数形式扩增双链DNA模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换