现代分子生物学蛋白质

现代分子生物学蛋白质第1页，课件共80页，创作于2023年2月1.蛋白质互作研究的意义2.蛋白质互作（事例）3.细胞内蛋白质标记4.其他进展References：BruceAlbertsetal,MolecularBiologyoftheCell(5thedition),GarlandScienceEricaGolemisetal,Protein-proteinInteraction—AMolecularCloningManualpapers第2页，课件共80页，创作于2023年2月1.蛋白质互作研究的意义(Importance)生命活动细胞活动:基因是关键基因表达调控与其它分子结合:信号转导转录蛋白质:修饰翻译蛋白作用单个蛋白:较少蛋白复合体动态蛋白质相互作用:结构,最具挑战性第3页，课件共80页，创作于2023年2月分子水平：基因组DNA：基因重排，Ig多样性基因序列多样性（Science.2004，305:251-254

），抵抗不同病原（低等动物）等作用

DNA修饰，甲基化（epigenomics），S修饰等mRNA：启动子，ChIP，EMSA

非编码小RNA（siRNA，miRNA，piRNA）（epigenomics）蛋白质：蛋白质互作（蛋白质组学）蛋白质结构（工具，生物信息学）蛋白质标记（细胞固定，活细胞标记）异构体第4页，课件共80页，创作于2023年2月第5页，课件共80页，创作于2023年2月第6页，课件共80页，创作于2023年2月2.蛋白质互作（protein-proteininteraction）事例第7页，课件共80页，创作于2023年2月病毒-对虾蛋白互作经济模式动物Whitespotsyndromevirus(WSSV)对虾:

无脊椎动物，仅有先天性免疫系统,无特异性免疫体表阻挡细胞系统：吞噬细胞、细胞凋亡体液防御系统：干扰素、抗病毒肽、凝集素等无脊椎动物免疫系统1)概述开始研究前，必须了解研究背景第8页，课件共80页，创作于2023年2月（1）模式识别：模式识别因子（2）信号转导：受体藕联蛋白信号转导（3）抗病毒效应：干扰素,抗病毒肽,细胞凋亡,细胞吞噬。蛋白质互作非特异性免疫第9页，课件共80页，创作于2023年2月特异性免疫Nature2005,434:27蛋白质互作如何开始研究?第10页，课件共80页，创作于2023年2月抗病对虾：mRNA差异显示技术（DD-PCR），抑制差减杂交，亲和层析36842751970个对虾抗病相关基因，其中30个新基因2)对虾抗病毒相关功能基因筛选第11页，课件共80页，创作于2023年2月Rab6:抗病毒对虾中上调表达说明在抗病毒免疫反应中起作用重要的小G蛋白第12页，课件共80页，创作于2023年2月小G蛋白:

GTPase,20-25kDa5个家族Ras:细胞生长调节Rho:actin细胞骨架重组,基因表达调控Rab:膜性颗粒的锚定与融合Arf:调节膜性颗粒的运输Ran:调控核内运输胞质细胞核Rab蛋白在体内以两种构象形式存在，活化的Rab蛋白为GTP结合形式，位于胞膜；未活化的Rab蛋白与GDP结合，位于胞浆。第13页，课件共80页，创作于2023年2月Cell,2007,129:865第14页，课件共80页，创作于2023年2月ThierryGalvezetal.2012.Cell151:234第15页，课件共80页，创作于2023年2月Rab蛋白:

所有的真核生物中都有Rab蛋白酵母中的Rab蛋白称为Ypt蛋白,7个Rab蛋白线虫(Celegans)29种Rab蛋白果蝇(Drosophilamelanogaster)26种Rab蛋白拟南芥(Arabidopsisthaliana)57种Rab蛋白人有60多种Rab蛋白

PM1-3，G1-3:与GTP结合/

分解相关的保守区,G结构域F1-5:Rab的保守区高度可变的N端和C端

第16页，课件共80页，创作于2023年2月G结构域:6个β折叠(β1-β6),5个α螺旋

(α1-α5)和5个多肽环。多肽环:β折叠与α螺旋之间由多肽环连接氨基酸序列高度保守

Mg2+和鸟嘌呤的结合位点，同时催化

GTP水解开关I和开关II:Rab蛋白与它的GEF和GAP的关键位点第17页，课件共80页，创作于2023年2月Rab6在抗病毒对虾中上调表达参与抗病毒免疫反应参与免疫的途径?筛选与Rab6结合的蛋白质蛋白互作GSTpull-down,CoIP,酵母(细菌)双杂交,噬菌体展示,蛋白质芯片,Native/SDS蛋白质鉴定蛋白互作验证功能3)互作蛋白筛选第18页，课件共80页，创作于2023年2月GST“X”“Y”GST(Glutathione-S-transferase

)pull-downassaySepharoseGSH

|BamH1|

|EcoR1||SmaI|SalI|XhoI|NotI|...ATCGAAGGTCGTGGGATCCCCAGGAATTCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCGC......TAGCTTCCAGCACCCTAGGGGTCCTTAAGGGCCCAGCTGAGCTCGCCGGCG......IleGluGlyArgGlyIleProArgAsnSerArgValAspSerSerGlyArg...|FactorXa|HistagSDSWesternblot第19页，课件共80页，创作于2023年2月Co-Immunoprecipitation(CoIP)不受互作蛋白结合位点影响蛋白条带较多第20页，课件共80页，创作于2023年2月nucleushis-leu-trp-Yeast2-HybridAssayMeasurableproductDBDbaittrpADfishleureporterDBDADhis细菌双杂交文库筛选，检测2个蛋白互作第21页，课件共80页，创作于2023年2月噬菌体展示第22页，课件共80页，创作于2023年2月蛋白质芯片第23页，课件共80页，创作于2023年2月第24页，课件共80页，创作于2023年2月4)互作蛋白的鉴定N端测序:Edmansequncing

需要大量纯化的蛋白质

N－末端封闭质谱(masspectrometry,MS)分析常用,基因组序列MALDI-TOFMS:matrix-assistedlaser-desorption/ionizationtime-of-flightESI-MS/MS:nano-electrosprayionizationtandemMS(Q-TOF)

MALDI-Q-TOF,TOF/TOF生物样品离子化方法第25页，课件共80页，创作于2023年2月5)蛋白互作的验证体外:Westernblot体内:细胞试验酵母(细菌)双杂交第26页，课件共80页，创作于2023年2月第27页，课件共80页，创作于2023年2月6)功能体内RNAi抑制Rab6基因的表达对血细胞吞噬功能的影响第28页，课件共80页，创作于2023年2月Rab6基因过量表达对血细胞吞噬功能的影响

Rab6基因沉默对病毒感染的影响

第29页，课件共80页，创作于2023年2月VP466Rabtropomyosinactin900-1020bp

互作片段第30页，课件共80页，创作于2023年2月信号通路VP466-tropomyosin-actinVP466：感染必需蛋白第31页，课件共80页，创作于2023年2月信号通路VP466-Rab6-actinRab6N端：与VP466互作必需体外体内VP466为Rab6的GAP第32页，课件共80页，创作于2023年2月信号通路VP466-Rab6-actinVP466激活Rab6，Rab6影响actin构象，促进吞噬第33页，课件共80页，创作于2023年2月信号通路VP466-Rab6-actin第34页，课件共80页，创作于2023年2月果蝇：Rab6-actin第35页，课件共80页，创作于2023年2月果蝇：Rab6-actin第36页，课件共80页，创作于2023年2月VP466Ranmyosinactin细胞吞噬细胞吞噬

RantropomyosinRabRNAioverexpressionNP小分子siRNA小G蛋白（Rab，Ran）与骨架蛋白直接作用调控吞噬病毒双功能蛋白第37页，课件共80页，创作于2023年2月蛋白质复合体标记病毒感染Rhodamine-Phalloidin

第38页，课件共80页，创作于2023年2月3.细胞内蛋白质标记（proteinlabelinginvivo）蛋白质互作：生化数据，体外分析细胞、个体观察：蛋白质标记第39页，课件共80页，创作于2023年2月荧光标记(fluorecencelabeling)常用：小分子有机染料与各种抗体相连接或特异的荧光标记物

，研究各种目的蛋白需要对细胞进行固定等操作进展：直接在活体细胞内标记某种细胞器、核酸分子或某些离子的荧光标记物荧光蛋白：非侵入性的活体细胞成像荧光蛋白-目的蛋白融合表达：过量表达目的基因失活突变体（株）第40页，课件共80页，创作于2023年2月1）荧光标记物2）标记蛋白技术3）应用第41页，课件共80页，创作于2023年2月1）荧光标记物小分子有机染料

分子量小于1KD与生物大分子共价连接对其进行标记染料的最佳检测波长范围、亮度，即吸光系数、光稳定性和自我淬灭特性利用：扩展共轭双键、额外添加环状结构增强其刚性、用氟或磺酸盐这类吸电子性的或带电荷的物质进行修饰等。有数百种荧光染料商品，如DAPI，FITC，Rhodamine，Hoechst，PI，DTAF，

phalloidin等多与抗体联用第42页，课件共80页，创作于2023年2月第43页，课件共80页，创作于2023年2月荧光蛋白

最早：藻胆蛋白（phycobiliproteins），蓝藻中提取的触角光合色素含有多种胆汁三烯生色基团，生色基团包裹在一种基质结构中，将它们的淬灭作用降至最小，因此这些藻胆蛋白的荧光亮度要比小分子荧光染料的亮度高出两个数量级。蛋白分子量200KD，限制了它们在细胞内的扩散，只能与抗体联用，在流式细胞或ELISA中用来检测细胞表面的蛋白质分子后来：维多利亚发光水母（Aequoreavictoria）中发现GFP，生物成像发生革命性改变，单独表达GFP或与其它蛋白融合表达GFP依赖钙离子第44页，课件共80页，创作于2023年2月荧光蛋白（GFP，RFP，YFP，CFP）大都来自海洋腔肠动物荧光蛋白发出的荧光一般对它们所处的生化环境都不太敏感，但酸性环境或变性剂的存在可以淬灭荧光第45页，课件共80页，创作于2023年2月第46页，课件共80页，创作于2023年2月量子点（QuantumDot）（2000）

无机纳米结晶体，冷光半导体纳米颗粒可根据其大小发出特定波长的荧光，具有非常高的消光系数（比小分子荧光基团和荧光蛋白高出10-100倍），量子产率也非常好典型的量子点都含有一个硒化镉（CdSe）或碲化镉（CdTe）核心，外面包裹一硫化锌（ZnS）外壳吸收波长范围覆盖从非常短的波长至略低于其发射波长的广阔范围，一束单波长激发光就可以让量子点达到多重发射量子点可以与抗体、抗生物素蛋白链菌素（streptavidin）等分子相连，但结合生物大分子的量子点体积过大（直径约10-30nm），阻碍它通过细胞膜结构，只能用于经透化处理的细胞或只能对胞外蛋白和可被细胞内吞的蛋白进行研究量子点的光稳定性使其能够反复成像，其大小和电子密度特性又使得它适合用于电镜研究在亲水的树枝状高分子聚合物中形成的金或银纳米点材料也能发出荧光，也具有波长可调性，这种新型材料可望在细胞生物学领域应用应用限制：与生物大分子连接，体积大第47页，课件共80页，创作于2023年2月量子点结构模式图量子点与抗体及生物素连接模式图ColorQtracker细胞标记效果3T3细胞(绿色),HeLa细胞(红色),U188细胞(白色)分别用Qtracker565,655,和705进行了荧光标记第48页，课件共80页，创作于2023年2月纳米颗粒BruceE.Cohen.2010.Nature467:407-408有机纳米颗粒：钛酸钡（BaTiO3）

可代替无机荧光染料用于活组织的成像荧光染料成像原理：荧光分子吸收光，发出比吸收光能量低的荧光吸收光与散射光的能量差异称为Stokesshift，保证发出荧光荧光染料的缺点：1）细胞本身有许多荧光分子，产生荧光背景

2）荧光显微镜的激发光可能损伤细胞，如紫外光等；光损伤可能间接发生，荧光分子与其它分子发生反应解决荧光染料的缺点：构建双光子显微镜（two-photonmicroscope）采用脉冲近红外线激光，发出比激发光能量高的光该文：采用第二次谐波产生技术发现bariumtitanate(BaTiO3)晶体（纳米颗粒），30nm

比核糖体的直径大2倍有望代替荧光染料的材料：量子点和纳米颗粒第49页，课件共80页，创作于2023年2月活细胞染色染料

InvitrogenproductlistC10106CellularLights™Tubulin-GFP*BacMam1.0*C10112CellularLights™Tubulin-RFP*BacMam1.0*C10126CellularLights™Actin-GFP*BacMam1.0*C10127CellularLights™Actin-RFP*BacMam1.0*O10100OrganelleLights™Lysosomes-RFP*BacMam1.0*O10104OrganelleLights™Endosomes-GFP*BacMam1.0*O36210OrganelleLights™Mito-GFP*BacMam1.0*O36231OrganelleLights™Endosomes-RFP*BacMam1.0*P36232Premo™FUCCICellCycleSensor*BacMam1.0*P36235Premo™AutophagySensorLC3B-GFP*BacMam2.0*P36236Premo™AutophagySensorLC3B-RFP*BacMam2.0*第50页，课件共80页，创作于2023年2月2）标记蛋白技术免疫标记法检测内源性蛋白最常用方法用特异性抗体（一抗）识别靶蛋白，再用标记有小分子有机染料、藻胆蛋白或量子点的二抗显色；或者，直接将荧光标记物或生物素连接在一抗上，然后再用抗生物素蛋白链菌素检测。如果没有高质量的抗体，可将荧光标记物与靶蛋白融合过量表达缺点：该方法只能用于经透化处理的细胞、胞外蛋白和可被细胞内吞的蛋白；抗体标记物的多价性可能会导致靶蛋白形成寡聚体荧光标记复合体通常分子量会超过200KD，可能影响蛋白互作第51页，课件共80页，创作于2023年2月++、+/-、-分别表示“应用范围较广”，“在某些领域内有所应用”，“较少应用”

第52页，课件共80页，创作于2023年2月遗传标记法荧光蛋白与靶蛋白融合表达，转染、转基因缺点：表达的蛋白不是内源性蛋白荧光蛋白分子大小会影响目的蛋白功能荧光蛋白的限制性改进：靶基因突变株或RNAi

活细胞内或细胞表面将小分子荧光标记物与目的蛋白共价连接或通过酶进行连接例：四半胱氨酸序列（tetracysteine）-biarsenical染料系统

●12aa肽段（含4Cys），Cys与透过细胞膜的biarsenical染料结合（高亲和力），形成FlAsH或ReAsH，发出绿色或红色荧光

●同时使用小分子二巯基化合物解毒剂可降低靶蛋白与染料间亲和力，减少毒性反应

●Tetracysteine对目的蛋白的影响比荧光蛋白小得多

●可用于亲和纯化、荧光蛋白辅助的光灭活作用、检测蛋白质合成过程、进行脉冲追踪标记、电镜定位等

●

biarsenical染料会造成背景荧光偏高，未用于转基因动物，不能同时对不同的蛋白标记上不同的颜色phalloidin:actin第53页，课件共80页，创作于2023年2月HaloTag技术

蛋白标记示踪+融合表达+蛋白分离具体步骤：

1.构建带有HaloTag和目标蛋白的融合表达载体

2.转染目标细胞，可按需要选择瞬时转染或稳定转染

3.培养细胞至表达产物

4.选择合适的荧光配基或生物素与细胞共同孵育5-60分钟，配基穿越细胞膜和HaloTag形成共价结合，然后洗掉未结合的配基。

5.分析研究：活细胞荧光成像；或者固定细胞成像；细胞裂解以及蛋白亲和纯化/捕获，或凝胶分析。第54页，课件共80页，创作于2023年2月3）应用蛋白质表达、蛋白质定位流式细胞：蛋白质表达、蛋白质活性特异结合磷酸化蛋白的被荧光标记的抗体，观察内源蛋白质的活化状态；荧光标记抗体，检测蛋白表达同时对17种荧光进行检测光镜/电镜：蛋白质定位

共聚焦显微镜观察荧光基团在光照下产生单线态氧，容易对荧光基团自身起漂白作用，而且可将局部的二氨基联苯胺氧化形成电镜下的嗜锇小体。量子点可以用于光镜和电镜A，B内源性蛋白一抗标记、染料-二抗标记D，E：融合表达荧光蛋白，tetracysteine标记第55页，课件共80页，创作于2023年2月Differentframesfromtime-lapsemicroscopyareshownforCID-GFP(DrosophilaCENP-A,centromeremarker)coexpressedwithH2B-mRFP(chromosomecounterstain)at1,64,83and138minutes.Purpleindicatescelloutlinestakenbytransmissionlight.共定位：质粒共表达第56页，课件共80页，创作于2023年2月CarolineGrabbeandIvanDikic.2008.Science322:872-873

IRES第57页，课件共80页，创作于2023年2月蛋白质在细胞内的弥散过程和运输过程蛋白在细胞内运动、分布、活化、信号通路、第二信使等，可通过成像技术观察其变化过程单粒子示踪技术（single-particletracking）：对单个分子、聚合物或细胞器等进行观察；被观测的粒子必须足够亮，彼此间隔足够大Rab（蓝），actin（红）细胞核（蓝）第58页，课件共80页，创作于2023年2月PhagocytosisofC.albicansbyDrosophilaS2Cells.TheDrosophilahemocyte-likeS2celllinephagocytosesC.albicans.S2cellswereco-incubatedwithGFPexpressingC.albicansfortheIndicatedtimes.Cellswerefixed,andthefilamentousactinofS2cellswasstainedwithRhodaminephalloidinandtheS2cellDNAwithHoechst33258.第59页，课件共80页，创作于2023年2月荧光相关光谱技术（Fluorescence

correlationspectroscopy）：针对分子荧光物理参数瞬时细微涨落的探测及其与时间相关处理的技术对荧光标记蛋白进入或离开某一激光焦点区域导致的荧光强度的改变情况进行统计学分析，以此来分析蛋白质的运动情况。记录的荧光分子的涨落是由于荧光分子扩散进入和逃出一个小的激发体积形成的，其中激发体积的大小由聚焦激发激光质量所决定。激发体积内分子发射的荧光强度是通过记录一个个光子获得的。假设激发光是稳定的，则荧光强度的涨落被定义为信号时间平均值的偏离。探测这些偏离可以获得的化学和物理参数是局部浓度、迁移率系数、结合和分离比例常数，以及酶动力学参数。衍生方法：影像相关光谱学技术，对荧光图像进行测量，发现不同图像间的变化情况，对细胞内蛋白间互作和蛋白动力学进行了解第60页，课件共80页，创作于2023年2月光标记技术（photomarkingmethods）：各种荧光蛋白都可以被破坏（图F）、被去淬灭或者被光活化作用改变颜色（图E），经过上述处理的荧光标记分子可直接进行成像研究E：光活化作用。强烈的光刺激改变局部荧光蛋白的发射光谱，从而发现蛋白运动情况F：FRAP作用。强烈的光刺激可以让局部的荧光被漂白，但新合成蛋白或从别处运动过来的蛋白仍然会发出荧光；

第61页，课件共80页，创作于2023年2月光脱色荧光恢复（Fluorescencerecoveryafterphotobleaching，FRAP)：先用荧光物质标记膜蛋白或膜脂，然后用激光束照射细胞表面某一区域，使被照射区域的荧光淬灭变暗形成一个漂白斑。由于膜的流动性，漂白斑周围的荧光物质随着膜蛋白或膜脂的流动逐渐将漂白斑覆盖，使淬灭区域的亮度逐渐增加，最后恢复到与周围的荧光光强度相等。根据荧光恢复的速度，可推算分子的扩散速度FRAP能证明膜的流动性，也能测量膜蛋白扩散的速率。第62页，课件共80页，创作于2023年2月量子点：因亮度和光稳定性非常高，可反复成像很难在活体细胞内对量子点标记的胞质蛋白进行观测

免疫靶向的抗生物素蛋白链菌素标记的量子点（immunotargetedstreptavidin-QDs）第63页，课件共80页，创作于2023年2月荧光标记技术在蛋白质构象改变研究中的应用

研究蛋白随时空间改变而发生构象改变时，最常用方法是将某一蛋白质结构域与2个荧光基团结合，然后对该结构的萤光共振能量转移（FRET）进行检测常用荧光基团有CFP、YFP等FRET传感器：底物经修饰（橙色，磷酸化修饰）导致构象改变，通过

FRET使发青色荧光的CFP发黄色荧光

FRET效率取决于供体与受体间的距离和方向FRET反映蛋白分子内部因方向而不是距离改变所造成的构象改变，因为荧光蛋白分子中有一个发生交替排列或者接头长度发生微小的改变都会给FRET带来很大的影响，这要比2个荧光蛋白分子间的距离改变对FRET

造成的影响大得多连接2个荧光蛋白的蛋白质在生化信号的影响下改变构象如果与定位信号序列融合，这种结构可用于对胞内特定的亚细胞结构研究第64页，课件共80页，创作于2023年2月荧光共振能量转移（FluorescenceResonanceEnergyTransfer，FRET）当一个荧光分子(供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(受体分子)的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。两个发色基团间能量转换效率与它们间的空间距离的6次方成反比，对空间位置的改变非常灵敏例用CFP作供体、YFP作受体，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。FRET技术原理示意图第65页，课件共80页，创作于2023年2月荧光标记技术在蛋白与蛋白互作中的应用FRET用于活体细胞内研究蛋白间互作（图）三分子FRET作用：蛋白X和Y结合后，使发青色荧光的CFP发黄色荧光，再与蛋白Z结合发红色荧光

这种方法已用于多蛋白复合体以及三聚体蛋白研究中第66页，课件共80页，创作于2023年2月BiFC技术可用于研究蛋白表达BiFC技术具有很高的信噪比，因为它可以形成新的荧光；试验花费时间长BiFC技术：蛋白X与Y结合导致GFP的2个裂解片段结合在一起，形成生色基团，发出绿色荧光

双分子荧光互补技术（bimolecularfluorescencecomplementation，BiFC）：原理：利用荧光蛋白及其突变体的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割成

2个不具有荧光活性的分子片段，分别与目标蛋白连接。若2个目标蛋白因为互作而靠近，使得荧光蛋白的2个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光。在荧光显微镜下，直接观察2目标蛋白是否有互作，且在最接近活细胞生理状态下观察其互作发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性，以及细胞信号分子对其互作的影响等第67页，课件共80页，创作于2023年2月第68页，课件共80页，创作于2023年2月荧光标记技术在蛋白质合成和降解过程研究中的应用

蛋白质降解：分辨“陈旧的”蛋白和“新生的”蛋白常用方法：用不可逆标记对某一时刻合成的所有蛋白质进行标记，再用另一种颜色的荧光对迟些时候新生成的蛋白质进行标记

例：1）用高亲和力配体或标记有荧光基团的抗体对内源性蛋白和胞外蛋白进行标记

2）先用一种双砷（biarsenical）染料标记四半胱氨酸（Tetracysteine）序列，然后用另一种双砷染料进行标记

FLAsH（bis-arsenicalfluorosceinderivative）：联砷荧光素衍生物合成的细胞可透

FLAsH结合四半胱氨酸:发夹型结合物

FLAsH（绿），ReAsH（红），HoXAsH（蓝），CHoX-As（蓝）等第69页，课件共80页，创作于2023年2月脉冲追踪技术：Tetracysteine序列标记的蛋白被绿色染料标记后，形成能发出绿色荧光的FIAsH（绿色小点）；去掉绿色染料后，用红色染料标记新生的蛋白，形成能发出绿色荧光的ReAsH（红色小点）

第70页，课件共80页，创作于2023年2月HaloTag标记

TNF-dependentdegradationofIkB-HaloTagfusionprotein.a)TimeseriesofimagesshowingHEK-293cellstransientlyexpressingtheIkB-HaloTagfusionproteinlabeledwiththeTMRligand.Degradationwaspreventedbytreatmentofthecellswith10Mlactacystinfor30min.b)Meancellularfluorescenceintensitiesweredeterminedateachtimepointc)WesternblotanalysisofIkB-HaloTagfusionproteindegradation.CellsweretreatedwithTNF-α(10ng/mL)andharvestedattheindicatedtimes.ProteinswereresolvedbySDSandvisualizedusingananti-IkBantibody.第71页，课件共80页，创作于2023年2月利用依赖生色基团的光灭活作用来控制蛋白质的活性通过免疫染色对目的蛋白进行标记，荧光基团受光照活化后会生成ROS，尤其是生成单线态氧，利用这种特性将目的蛋白灭活摧毁胞内靶蛋白效率：ReAsH>FlAsH>荧光素>>孔雀绿>GFP这种灭活蛋白的方法比基因敲除或RNA干扰好H：电镜下光氧化作用。对ReAsH（红色小点）进行强烈的光刺激后，