第3章核酸化学-32hr修改稿教学课件

第三章

核酸化学

一．核酸研究的历史和重要性

历史：

l

1896年瑞士青年科学家F.Miescher首先发现核酸。

从外科绷带的脓细胞核中分离到含磷很高的酸性化

合物——称为核素。

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后经40-50年的证明核酸的组成——核苷酸单体

l

19世纪末—20世纪20年代发现：

核酸的四种碱基；核糖核酸(RNA)

根据核糖不同核酸可分为

脱氧核糖核酸(DNA)l

1944年Avery（美）OswaldTheodoreAvery，

(1877～1955）加拿大生物化学家

通过细菌转化实验证明DNA是遗传物质——功能。

l

1953年Watson（美）Crick（英）

提出了DNA的双螺旋结构模型。l

1960年Crick提出了中心法则。

l

1973年初DNA体外重组成功。

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2019年人类基因组计划。

重要性：核酸是遗传变异的物质基础；

多数生物的遗传物质是DNA；

少数病毒以RNA作为遗传物质。二．核酸的分类

根据含戊糖的不同分为：RNA——核糖核酸

DNA脱氧核糖核酸

DNA：含脱氧核糖，98%以上存在于细胞核中。

在核中与组蛋白结合成核蛋白，形成染色体；

少量存在于线粒体、叶绿叶、质粒中。

RNA：90%存在于细胞质中，10%在核中。信使核糖核酸mRNA

RNA按功能分为转运核糖核酸tRNA

核糖体核糖核酸rRNA

l信使核糖核酸mRNA：

在核中合成，存在于细胞质中；

作为蛋白质合成的模板，是将DNA的遗传信息传递

到蛋白质的桥梁。

l

转运核糖核酸tRNA：

在核中合成，存在于细胞质中；

作为搬运的工具，携带转运氨基酸到核糖体。l

核糖体核糖核酸rRNA：

在核仁中合成，存在于细胞质中；

与蛋白质结合构成核糖体，作为蛋白质合成场所。三．核酸的组成

（一）元素组成

C、H、O、N、P，个别含S

P含量比较恒定，约9～10%，是核酸的特征元素。

测核酸含量常用定P法：

◆各种核酸含磷量比较接近；

◆磷易于测定。

1gP≈10.5g核酸（二）化学组成——核酸的基本组成单位是核苷酸

两类核酸（DNA，RNA）经不同程度的水解可得到

一系列产物，完全水解的三类终产物是：

磷酸、戊糖（5C）、碱基。

磷酸

核酸→核苷酸戊糖（核糖或脱氧核糖）

核苷

碱基（嘌呤或嘧啶）

两类核酸（DNA与RNA）的区别:戊糖、碱基差异。

戊糖（β－D－核糖）

RNA

碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶）

戊糖（β－D－2－脱氧核糖）

DNA

碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶）1．磷酸：RNA、DNA两类核酸均含有。

2．核糖和脱氧核糖

1‘1‘2‘2‘3‘3‘4‘5‘4‘5‘3．碱基－嘌呤碱和嘧啶碱

碱基：是一些含N的杂环化合物，是嘌呤和嘧啶的衍生

物，具有碱性。

（1）嘧啶碱

三种基本嘧啶碱基：

嘧啶

稀有碱基：核酸中一些含量甚少的碱基，大多是由基本

碱基上发生甲基化。（2）嘌呤碱：

由一个嘧啶环和一个咪唑环形成的杂稠环。

两种基本嘌呤碱基：

嘌呤

NH2

糖苷键4．核苷：由碱基和戊糖脱水缩合而成的糖苷。

碱基与糖连接方式：糖苷键（N－糖苷键）

嘧啶核苷：C1′－N1

：由糖C1′与嘧啶N1相连。

嘌呤核苷：C1′－N9

：由糖C1′与嘌呤N9相连。根据所含戊糖不同分为↗核糖核苷－核苷

↘脱氧核糖核苷－脱氧核苷

嘧啶核苷嘌呤核苷

碱基环元素编号：1,2,3等；

糖环元素编号：1´,2´,3´等。

核苷命名：先读碱基名称。如：腺苷，胞苷，尿苷。1’2’3’4’5’(OH)1’2’3’4’5’(OH)5．核苷酸

核苷酸：由核苷与磷酸形成的磷酸酯叫核苷酸。

由核苷的戊糖的－OH与磷酸成酯。

核糖上有三个自由羟基（2’、3’、5’）可与磷酸成酯，

可形成三种形式的核苷酸：2’-核苷酸；

3’-核苷酸；

5’-核苷酸。

举例：

脱氧核糖有两个自由羟基（3’、5’）可与磷酸成酯，

可形成两种形式的核苷酸：3’-脱氧核苷酸；

5’-脱氧核苷酸。

举例：

生物体内存在的核苷酸多为5’-核苷酸。6．多磷酸核苷酸

核苷酸含有不止一个磷酸，为多磷酸核苷酸，在体

内具有重要的生理作用。

如：参与体内多种物质合成代谢。

AMP：腺苷一磷酸

ADP：腺苷二磷酸

ATP：腺苷三磷酸

7．环状核苷酸。

如：3’、5’-环状腺苷酸。

磷酸与核糖的3’及5’位碳同时以两个酯键相连。

作用：环状核苷酸含量很少，但是在体内的代谢中起

重要的调节作用。常见的有cAMP，cGMP。四、DNA的结构（deaxyribonucleicacid-DNA）

DNA形状：多为双链，少数单链；

多为线状（单、双），

少数环状（单、双）；

无支链。

分子量大：106——109。

一级结构

DNA的结构二级结构

空间结构

三级结构（一）

DNA的一级结构

1．构成DNA的各种脱氧核苷酸的排列顺序。

核苷酸连接方式：3′,5′—磷酸二酯键。

5’5’3’3’简写式

（1）线条式：

竖线表示核糖的碳链；

A、T、G、C——碱基；

P——磷酸基；

P一端与C3’相连，另一端与C5’相连；

（2）文字式：

P——在碱基左侧表示P与C5’相连；

在碱基右侧表示P与C3’相连。（二）DNA的二级结构——DNA的双螺旋结构

DNA的双螺旋结构，由Watson，Crick于1953年提出。

1．双螺旋结构的模型要点:

（1）DNA由两条多核苷酸链围绕同一中心轴向右缠绕成双螺

旋，两链彼此平行，走向相反。

2.0nm小沟大沟（2）每条链以脱氧核糖和磷酸为骨架(主链），处在

双螺旋的外侧；

糖与磷酸之间以磷酸二酯键相连；

糖环平面基本与螺旋轴平行。

2.0nm小沟大沟（3）碱基在双螺旋内侧，碱基环平面与螺旋轴相垂

直，两相邻碱基之间的距离为0.34nm——碱基堆

积距离。

2.0nm小沟大沟（4）两条链之间通过碱基之间的氢键结合在一起；两

链间形成氢键具有一定的碱基配对原则。

配对原则：由一条链的嘌呤碱与另一条链的嘧啶碱

配对——碱基互补；

而且必须A与T配对，形成两条氢键A=T；

G与C配对，形成三条氢链G≡C。.

配对的碱基彼此称为互补碱基。

根据碱基互补原则，当一条多核苷酸链的序列确定后即

可推知另一条互补链的序列。（5）螺旋每上升一圈，含十对碱基，上升一圈的距离

3.4nm，两相邻核苷酸之间的夹角为36°，螺旋

直径为2nm。

成对碱基大致在同一平面，碱基与螺旋轴垂直；

两相邻碱基之间的距离为0.34nm

——碱基堆积距离。

上述为B-型DNA的结构，生物体主要为B-DNA。

其他结构：A-DNA,；

C-DNA；

Z-DNA。

（6）多数天然DNA为双链结构（dsDNA），少数病毒

DNA为单链（ssDNA）。2．维持DNA双螺旋结构的稳定的作用力

（1）互补碱基对之间的H键——不是主要力

因为H键的力很小，而且断裂时具有协同性。

（2）碱基堆积力——主要作用力

碱基对之间电子云可以在一定程度上相互交盖，

形成碱基堆积力。

(3)离子键

由磷酸基团的负电荷与介质中阳离子之间形成。

减少了DNA分子自身的斥力。（三）DNA的三级结构

三级结构：指DNA在二级结构的基础上，进一步卷曲

或再次螺旋，即为三级结构。四、DNA与基因组

（一）

DNA与基因

基因：DNA分子中最小的功能单位称为基因。

基因：结构基因

调节基因

基因组：某种生物体所含的全部基因的总和称为该生物

的基因组。（二）原核生物与真核生物基因组特点

原核生物：基因组比较简单，通常只有一个DNA分子

（一个染色体，且分子比较小。

真核生物：基因组比较复杂，一般含有若干个DNA分

子（多个染色体）。

如：人23对染色体。五、RNA的结构与功能

RNA主要存在于细胞质中，有多种不同功能，多数天然RNA分子为一条单链，一些区域可自身回折，形成局部的双螺旋。

碱基组成：四种：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、

胞嘧啶（C）、尿嘧啶（U）；

还有一些稀有碱基。

碱基之间不像DNA那样有严格的组成规律

即：A≠U，G≠C；

但：A≈U，G≈C。

原因：RNA分子为单链不是双螺旋，只有局部回折形

成双螺旋。(一)tRNA

含量：占全部RNA的15%。

功能：

1．携带转运AA到核糖体，合成蛋白质；

tRNA的AA臂与AA结合携带AA，每种AA只能由特

定的tRNA搬运；2．识别密码——反密码子环上的反密码子能与mRNA

上的密码子通过碱基互补配对而识别、结合。

特点：每种AA至少有一种特定的tRNA。

细胞内一般有50种以上不同的tRNA。

真核细胞生物细胞tRNA甚至可多达100多种。结构特点：

1．分子量比较小25000道尔顿左右，由70-90个碱基组

成，沉降系数4s左右。

2．碱基组成有较多的稀有碱基。

3．3’-端都为——CpCpA-OH。接合活化的氨基酸（与

氨基酸结合）故称为接受末端。

4．5’端，大多为pG…或者pC…..。5．二级结构都呈类似的三叶草结构：

叶柄：有局部双螺旋构成，A=U，G=C配对。

三片小叶：由突环构成。三叶草分为以下几部分：

l

氨基酸臂：

7对碱基对组成，富含G，包括3’和5’两个末端。

3’-末端最后三个碱基CCA-OH，接受活化氨基酸。

l

二氢尿嘧啶环：含两个二氢尿嘧啶。

环：由8-12个核苷酸组成。

臂：由3-4对碱基对——二氢尿嘧啶臂。

l

反密码子环

环：7个核苷酸组成，环正中三个核苷酸为反密码子。

臂：由5对碱基组成。l

额外环

由3-18个核苷酸组成，环大小变化较大，不同的

tRNA具有大小不同的额外环。

l

TΨC环

环：由7个碱基组成，大多tRNA均含T和Ψ。

T——胸腺嘧啶核糖核苷

Ψ——假尿嘧啶核苷

臂：由5对碱基组成。6．三级结构

在二级结构基础上，整个分子的扭曲使未配对碱基按碱基配对原则形成氢键，构成三维结构，似一倒“L”形。（二）

rRNA

含量：占全部RNA的80%左右，存在于核糖体内。

作用：

（1）与蛋白质结合形成核糖体，作为蛋白质合成场所。

核糖体＝rRNA（60%）+蛋白质（40%）

（2）在蛋白质合成中起催化作用。核糖体（核蛋白体，核糖核蛋白体）：

分布在细胞质内的微小颗粒，直径20—30nm。

游离存在（少）；附着在内质网上（多数）。

特点：成分稳定代谢不活跃，分子量大10-6。

核糖体为一大一小两个亚基，原核真核不同。

rRNA结构——类三叶草（三）

mRNA

含量：占全部RNA的3-5%。

作用：以DNA为模板合成，作为蛋白质合成的模板，

mRNA的核苷酸序列，决定相应蛋白质的氨基

酸序列。

将DNA的遗传信息传向蛋白质的桥梁。

特点：代谢活跃，更新快，分子量差异较大。

（四）RNA的其它功能

1981年发现有些RNA具有生物催化剂的功能。

核酶：具有催化活性的RNA。四、核酸的性质

（一）一般理化性质

1．两性性质

核酸含酸性的磷酸基和碱性的碱基（嘌呤，嘧啶）

为两性电解质，但是通常表现为酸性。

2．DNA、RNA分子量都很大DNA＞RNA。

DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末。

微溶于水，不溶于有机溶剂。常用乙醇从溶液中沉

淀核酸。3．粘度很大

DNA为线性或环状分子，长约1um-4um不等，直径

2nm。

直径：长度可达到10-7，故黏度很大。

RNA粘度<DNA

DNA由于形成双螺旋，分子具有一定的刚性。

但由于直径：长度比很大，又有一定的柔性。（二）

紫外吸收性质

核酸的碱基对240-290nm紫外光有强烈的吸收。其

最大的吸收峰在260nm。应用：

１．纯度鉴定——定性

最大吸收峰：核酸：260nm

蛋白质：280nm

由OD260/OD280比值可鉴定核酸的纯度。

∵纯DNAOD260/OD280为1.8

纯RNAOD260/OD280为2.0

∴如果核酸中含蛋白质杂质，OD260/OD280↓。

（蛋白质λMAX=280nm）；

DNA中含RNA杂质，OD260/OD280↑。2．DNA和RNA的定量测定

（1）纯核酸样品由OD260可直接测含量。

（条件：pH=7,比色皿厚度1cm）

1OD=50ug/mlDNA双螺旋

1OD=40ug/ml单链DNAorRNA

1OD=20ug/ml寡聚核苷酸（2）由摩尔磷消光系数表示核酸含量

摩尔磷消光系数ε(p)：

每升含1mol磷的核酸溶液(pH7)的消光值(光吸收

值)。

在260nm天然RNAε(p)7000--10000

天然DNAε(p)6000--8000（三）核酸的变性

1.核酸变性：受某些理化因素的影响，核酸分子中双螺

旋碱基对之间的氢键而破裂，双螺旋解开

变成单链的过程。（分子量不变）变性因素：（１）温度升高。

（２）有机溶剂。

（３）变性剂。

（４）4>pH>10。变性结果：

（１）紫外吸收增加-----增色效应：

由于核酸变性而引起紫外吸收增加的现象。

原因：变性后碱基暴露，光吸收增强。

（２）粘度下降。（η↓）

原因：分子由双螺旋（具有一定刚性）变成线

团状。

（３）浮力密度上升。（ρ↑）

（４）生物活性丧失。2.DNA热变性和Tm：

过程：

DNA溶于稀盐溶液→加温到80-100℃→双螺旋H键断

裂成两股单链，紫外吸收骤然增加。

热变性特点：

爆发式的——变性作用发生在一个很窄的温度范围内，

而不是随温度升高而逐渐发生，类似固态

结晶的熔解。

DNA热变性温度称为熔点（融点），用Tm表示

Tm：紫外吸收的增加量（增色效应）达最大量一半时的

温度。

（加热变性使DNA双螺旋结构失去一半时的温度。）

DNATm值一般在70—85℃，不同的DNA，Tm不同。3．影响Tm的因素

（1）G-C含量：

含G-C高，Tm高；因为G-C含3对氢键；

含A-T高，Tm低；因为A-T含2对氢键。

（2）溶液的离子强度：

离子强度低，Tm低。

（3）溶液pH：高pH使核酸失去质子，丧生成H键的

能力。低pH易脱嘌呤。

（4）变性剂——破坏H键（四）复性

复性：变性的DNA在适当条件下，两条彼此分开的互补

链重新碱基配对形成双螺旋的过程。

DNA热变性及复性示意图

复性后一系列理化物性及生物学活性可恢复。

减色效应：核酸在复性过程中紫外吸收值降低的现象。影响复性的因素：

(1)

热变性的DNA：缓慢冷却可复性，且可逆复性。

——退火(Annealing)。

骤然冷却不可复性。（2）单链浓度高，随机碰撞机会多，复性速度快。

（3）片断大，不易复性。

（4）片断重复序列高，易复性。

（5）维持溶液一定的离子强度，以减少核酸磷酸基的

负电荷斥力。

五、核酸的分子杂交和印迹技术

分子杂交：不同来源的单链DNA，如有相同区段（碱

基互补区），互补形成双链DNA—DNA，

or单链DNA与RNA互补形成DNA—RNA

杂合双链的过程叫分子杂交。杂交可发生在：

DNA–DNA:Southern