生物化学第四章酶文稿教学课件

生物化学第四章酶文稿演示（3）降低反应所需的活化能例2H2O2→2H2O+O2

反应活化能非催化反应75.24kJ/mol钯催化反应48.9kJ/molH2O2酶催化8.36kJ/mol2．酶作为生物催化剂的特殊点（1）高的催化效率以摩尔为单位进行比较，酶的催化效率比化学催化剂高107～1013倍，比非催化反应高108～1020倍。例2H2O2→2H2O+O2

1moleH2O2酶能催化5×106moleH2O2的分解1moleFe3+只能催化6×10-4moleH2O2的分解转换数（turnovernumber,TNorkcat）:每秒钟或每分钟，每个酶分子转换底物的分子数，或每秒钟或每分钟每摩尔酶转换底物的摩尔数。（2）高的专一性（3）温和的反应条件（4）酶在体内受到严格调控如酶浓度的调节、激素调节、反馈调节、抑制剂和激活剂的调节、别构调节、酶的共价修饰调节、酶原活化等。（5）酶的催化活力与辅酶、辅基和金属离子有关（三）酶的化学本质1．大多数酶是蛋白质（Mostenzymesareproteins）1926年美国Sumner脲酶的结晶，并指出酶是蛋白质1930年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了酶是蛋白质。J.B.SumnerJ.H.Northrop

20世纪80年代发现某些RNA有催化活性，还有一些抗体也有催化活性，甚至有些DNA也有催化活性，使酶是蛋白质的传统概念受到很大冲击。2．某些RNA有催化活性1982年美国T.Cech等人发现四膜虫的rRNA前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现RNA有催化活性ThomasCechUniversityofColoradoatBoulder,USA1983年美国S.Altman等研究RNaseP（由20%蛋白质和80%的RNA组成），发现RNaseP中的RNA可催化E.colitRNA的前体加工。SidneyAltmanYaleUniversityNewHaven,CT,USACech和Altman各自独立地发现了RNA的催化活性，并命名这一类酶为ribozyme（核酶），2人共同获1989年诺贝尔化学奖。1．Cellvol31,147～157，1982年。2．Sci.Amer.Vol255,64～75，1986。3．抗体酶（abzyme）

抗体：与抗原特异结合的免疫球蛋白。抗体酶：指具有催化功能的抗体分子，在抗体分子的可变区（即肽链的N端）是识别抗原的活性区域，这部分区域被赋予了酶的属性。1986年美国Schultz和Lerner两个实验室同时在Science上发表论文，报道他们成功地得到了具有催化活性的抗体。抗体酶的性质抗体酶的用途抗体酶可催化多种化学反应，包括酯水解、酰胺水解、酰基转移、光诱导反应、氧化还原分应、金属螯合反应等。其中有的反应过去根本不存在一种生物催化剂能催化它们进行，甚至可以使热力学上无法进行的反应得以进行。抗体酶的研究，为人们提供了一条合理途径去设计适合于市场需要的蛋白质，即人为地设计制作酶。它是酶工程的一个全新领域。利用动物免疫系统产生抗体的高度专一性，可以得到一系列高度专一性的抗体酶，使抗体酶不断丰富。随之出现大量针对性强、药效高的药物。立本专一性抗体酶的研究，使生产高纯度立体专一性的药物成为现实。以某个生化反应的过渡态类似物来诱导免疫反应，产生特定抗体酶，以治疗某种酶先天性缺陷的遗传病。抗体酶可有选择地使病毒外壳蛋白的肽键裂解，从而防止病毒与靶细胞结合。抗体酶的固定化已获得成功，将大大地推进工业化进程。4．有些DNA也有催化活性1995年Cuenoud等发现有些DNA分子亦具有催化活性。（四）酶的组成

1．单纯蛋白质酶类2．缀合蛋白质酶类全酶=酶蛋白+辅助因子（辅酶、辅基或金属离子）辅基（prostheticgroup）结合比较紧，用透析的方法不易除去的小分子物质辅酶（coenzyme）和酶蛋白结合较松，用透析的方法可以除去的小分子有机物金属离子或小分子有机化合物辅酶不具备专一型，酶的催化专一性由酶的蛋白质部分决定（五）根据酶蛋白分子的特点将酶分成三类

1．单体酶（monomericenzyme）一条肽链，水解酶2．寡聚酶（oligomericenzyme）几个或多个亚基组成，亚基之间以非共价键集合，大多为糖代谢酶3．多酶复合物（multienzymecomplex）几个酶嵌合而成的复合物2-6个功能相关的酶组成丙酮酸脱氢酶复合物和脂肪酸合成酶复合物二、酶的命名和分类

1961年国际酶学委员会（enzymecommission）提出的酶的命名和分类方法。（一）命名1．系统名称（systematicname）（1）标明底物，催化反应的性质G-6-P→F-6-PG-6-P异构酶例:（2）两个底物参加反应时应同时列出，中间用冒号（:）分开。如其中一个底物为水时，水可略去。例1：丙氨酸+α-酮戊二酸→谷氨酸+丙酮酸丙氨酸:α-酮戊二酸氨基转移酶例2：脂肪+H2O→脂酸+甘油脂肪水解酶2．习惯名称（recommendedname）（1）底物（2）反应性质（3）底物，反应性质（4）来源或其它特点（二）系统分类法及编号1．分类:6大类酶，氧转水裂异连2．编号:用4个阿拉伯数字的编号表示，数字中用“·”隔开，前面冠以EC（为EnzymeCommission）。EC类.亚类.亚亚类.排号，如ECl.1.1.1EnzymeHandbook，ThomasEBarman编，VolI,VolII1969年。EnzymeHandbook，ThomasE.Barman编SupplementI,1974年。（三）六大类酶催化反应的性质1．氧化还原酶类（oxido-reductases）催化氧化还原反应的酶，包括氧化酶类、脱氢酶类、过氧化氢酶、过氧化物酶等。p329（1）氧化酶类：催化底物脱氢，并氧化生成H2O或H2O2。2A·2H+O22A+2H2OA·2H+O2A+H2O2

邻苯二酚氧化酶（EC1.10.3.1，邻苯二酚：氧氧化酶）邻苯二酚邻苯醌例：（2）脱氢酶类：直接催化底物脱氢A·2H+B

A+B·2H例：乳酸脱氢酶（EC1.1.1.27，L-乳酸：NAD+氧化还原酶）乳酸丙酮酸2．转移酶类（transferases）催化基团的转移例：谷丙转氨酶（GPT）（EC2.6.1.2，L-丙氨酸：α—酮戊二酸氨基转移酶）3．水解酶类（hydrolases）AB+H2O A·OH+BH蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶，蔗糖酶4．裂合酶类（lyases）从底物移去一个基团而形成双键或逆反应ABA+B例1：草酰乙酸脱羧酶碳酸酐酶例2：5．异构酶类（isomerase）催化异构化反应例：6．连接酶类（ligases,也称synthetases合成酶类）将两个小分子合成一个大分子，通常需要ATP供能。例：

（连接酶）（异构）（裂合）（水解）（一）酶的活性中心（activecenter）和必需基团活性中心的概念酶是蛋白质，是大分子化合物，在这样一个大分子中只有一小部分是与底物结合，并与催化作用直接有关，这个部位称酶的活性中心。不需要辅酶的酶：活性中心就是酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个AA残基或是这些残基上的某些基团需要辅酶的酶：辅酶分子或辅酶分子上的某一部分结构往往就是活性中心的组成部分活性中心的两个功能部位：结合部位和催化部位三、酶的结构与功能的关系

组成酶活性中心的氨基酸侧链基团主要有Glu和ASP的-COOH，Lys的ε-NH2，His的咪唑基，Ser的-OH，Cys的-SH，Tyr的侧链基团。酶活性中心

结合部位（结合位）

催化部位（催化位）

底物靠此部位和酶分子结合底物的键在此处被打断或形成新的键，从而发生一定的化学变化（二）酶原的激活1、胃蛋白酶原（pepsinogen）的激活2、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活3、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活（三）同工酶（isoenzymeorisozyme）

1同工酶的概念同工酶的概念同工酶的性质2乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase,LDH）组成和电泳行为HHHH(LDH1)HHHM(LDH2)HHMM(LDH3)HMMM(LDH4)MMMM(LDH5)功能催化的反应乳酸丙酮酸LDH5骨骼肌:乳酸丙酮酸心肌:LDH1同工酶研究的意义

代谢调节、个体发育、细胞分化、分子遗传等方面蛋白质的结构和功能临床和农业四、酶的专一性（一）酶的专一性（特异性，specificity）1、绝对专一性（absolutespecificity）例:（1）族专一性（基团专一性，groupspecificity）2、相对专一性（relativespecificity）A—B或A—B如α-D-葡萄糖苷酶（2）键专一性A—B3、立体专一性（stereospecificity）（1）D-，L-立体异构专一性乳酸脱氢酶催化L－乳酸脱氢转变为丙酮，而对D-乳酸无作用（2）酶能区分从有机化学观点来看是属于对称分子中两个等同的基团，只催化其中的一个基团，而不催化另一个。例1：若甘油激酶不能区分两个—CH2OH基团，则会生成:和（二）关于酶作用专一性的几种假说1、锁钥学说（lockandKeytheory）1894年Fischer提出底物分子或底物分子的一部分象钥匙那样，专一地锲入到酶的活性中心部位。底物分子进行化学反应的部位与酶分子上有催化效能的必需基团间有紧密的互补关系2、三点附着学说立体对映的一对底物基团相同但是空间排列不同，基团与酶分子活性中心的结合基团不能匹配，只有三点都匹配时，酶才能作用于这个底物。3、诱导契合学说（induced-fittheory）1958年Koshland提出“刚性模板学说”不能解释可逆反应AB为催化基团C为结合基团底物上加了个庞大的基团底物上切除了某些基团五、酶的作用动力学（kinetics）什么是酶作用动力学？酶促反应动力学(kineticsofenzyme-catalyzedreactions)是研究酶促反应速度及其影响因素的科学这些因素主要包括酶的浓度、底物的浓度、pH、温度、抑制剂和激活剂等酶促反应动力学的研究有助于阐明酶的结构与功能的关系，也可为酶作用机理的研究提供数据；有助于寻找最有利的反应条件，以最大限度地发挥酶催化反应的高效率；有助于了解酶在代谢中的作用或某些药物作用的机理等，因此对它的研究具有重要的理论意义和实践意义。（一）底物浓度对酶反应速度的影响1．米氏方程的提出P356底物浓度较低时，反应速度随底物浓度增加而升高，反应速度与底物浓度成正比底物浓度很大时，底物浓度增加，反应速度几乎不变底物浓度较高时，底物浓度增加，反应速度升高，但不显著第一步:E+SES中间复合物学说：第二步:ES→E+PV∝[ES]

1913年Michaelis和Menten推导了米氏方程2．米氏方程的推导基本前提：反应方程式:在米氏方程推导中引入3个假设:（1）P→0忽略这步反应（2）∵[S]>>[E] ∴[S]－[ES]≈[S]（3）E+S ES平衡，要求k3<<k2。中间复合物学说:E+SES→E+PV∝[ES]恒态法推导：1925年Briggs和Haldame对米氏方程作了一次重要的修正，提出了恒态的概念。所谓恒态是指反应进行一定时间后，ES的生成速度和ES的分解速度相等，亦即ES的净生成速度为零，此时ES的浓度不再改变，达到恒态，也称稳态。恒态法推导要点推导方法p357结果:3．米氏方程的讨论米氏方程与一级反应和零级反应底物浓度很低时，Km>>[S]，[S]忽略不计，V=Vmax[S]/Km反应速度与底物浓度成正比，符合一级反应。底物浓度很高时，Km<<[S]，Km忽略不计，V=Vmax反应速度与底物浓度无关符合零级反应。4．米氏常数的意义米氏常数的物理意义涵义是反应速度为最大反应速度的一半时的底物浓度Km值可用来表示酶和底物的亲和力Km大表示酶和底物亲和力小，反之。有关米氏常数说明几点（1）Km是酶的一个特征性常数，只与酶的性质有关，与酶的浓度无关（2）如酶能催化几种不同的底物，对每种底物都有一个特定的Km值，其中Km值最小的称该酶的最适底物。（3）Km除了与底物类别有关，还与pH、温度有关，所以Km是一个物理常数，是对一定的底物、一定的pH、一定的温度而言的。（4）只有在特殊情况下即k2>>k3，Km=K2/K1时，Km可表示酶和底物的亲和力。5．米氏常数的求法（1）v对[S]作图（2）双倒数作图法（Lineweaver-Burk作图法）P110将米氏方程改写成（二）酶浓度对酶反应速度的影响1．反应速度与酶浓度成正比[S]>>[E] V∝[E]2．V与[E]关系的几点讨论（三）pH对酶反应速度的影响1．酶反应的最适pH（optimumpH）酶的最适pH不是一个固定的常数，它受到底物的种类、浓度;缓冲液的种类、浓度;酶的纯度;反应的温度、时间等的影响。例:碱性磷酸酶催化磷酸苯酯水解时[s]为2.5x10-5M，最适pH为8.3[s]为2.5x10-2M，最适pH为10.02．pH影响反应速度的原因(1)pH影响了酶分子、底物分子和ES复合物的解离状态。(2)过高、过低的pH导致酶蛋白变性。（四）温度对酶反应速度的影响1．最适温度（optimumtemperature）最适温度与最适pH一样，也不是一个固定的常数，它随底物的种类、浓度,溶液的离子强度,pH,反应时间等的影响。例:反应时间短，最适温度高。反应时间长，最适温度低。（五）激活剂对酶反应速度的影响什么是激活剂（activator）?酶的激活剂1.无机离子（1）一些金属离子，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+等。①专一性②有的金属离子可以互相替代③有的离子间有拮抗作用（2）阴离子：如Cl-、Br-、I-、CN-等（3）氢离子2.有机分子3.具有蛋白质性质的大分子，如酶原可被一些蛋白酶激活，蛋白酶可看作为激活剂。（2）EDTA（1）某些还原剂如Cys、GSH等（六）酶的抑制作用和抑制作用动力学

什么是抑制作用（inhibition）?研究抑制作用的意义1、不可逆抑制作用（irreversibleinhibition）E+I→EI例:二异丙基氟磷酸DFP（DIFP）对胰凝乳蛋白酶的抑制凡使酶的必需集团或酶活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶完全丧失活性的物质，称为抑制剂，用I表示，其作用称为抑制作用。2、可逆抑制作用(reversibleinhibition)及其动力学（1）竞争性抑制作用（competitiveinhibition）E+IEI

抑制剂与酶结合后可用透析等方法除去抑制剂使酶恢复活力例:丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用延胡索酸①竞争性抑制作用动力学方程的推导竞争性抑制作用可用下式表示:EI+S→noreaction推导的要点推导出的方程有竞争性抑制剂存在时，Km值增大1+[I]/Ki倍，而且Km值随着[I]增高而增大②竞争性抑制作用动力学方程的讨论A、与标准米氏方程比较B、当[I]→0时，方程还原成米氏方程。[I]→∞时，C、取方程的倒数，进行双倒数作图D、抑制程度:有I存在时，改变Km而不改变Vmax的作用，竞争性抑制作用的特点时当底物浓度很高时，抑制作用可以被解除当[S]→很大很大≈

≈0（2）非竞争性抑制作用（noncompetitiveinhibition）E+S→ESESIE+I→EIESI①非竞争性抑制作用动力学公式推导非竞争性抑制作用可用下式表示:经推导后得方程:②非竞争性抑制作用动力学方程讨论A、与米氏方程比较B、当[I]→0[I]→∞C、取方程倒数，进行双倒数作图D、抑制程度:非竞争性抑制作用的机制可能是抑制剂作用于酶活性部位中催化基团，也可能是维持酶分子构象的必需基团作用，而使酶的活性降低两种可逆抑制作用的总结酶先与底物结合再与抑制剂结合P373（3）反竞争性抑制作用（anticompetitiveinhibition）

类型VmaxKm无抑制剂VmaxKm竞争性抑制剂不变增加非竞争性抑制剂减小不变反竞争性抑制剂减小减小3、一些重要的抑制剂及其实际意义（1）不可逆抑制剂：E+I→EI或有机磷化合物化学结构通式:R1、R2:烷基;X:-F,-CN等这些有机磷化合物能抑制某些蛋白酶及酯酶的活力，特别是强烈抑制胆碱酯酶。使昆虫体内的乙酰胆碱大量积累，影响神经传导，使昆虫功能失调，失去知觉而死亡。胆碱＋乙酸乙酰胆碱乙酰胆碱酶胆碱酯酶有机磷化合物中常用的是DFP以及有机磷杀虫剂，如1605、敌百虫、敌敌畏、乐果等。（2）可逆抑制剂最常见的是竞争性抑制剂例1：磺胺药中的对一氨基苯磺酰胺对氨基苯磺酰胺与PABA两者竞争FH2合成酶（PABA）细菌：PABAFH2合成酶FH2FH4人服用的磺胺药物作为竞争性抑制剂和细菌体内的FH2合成酶结合，从而使细菌体内代谢紊乱，细菌繁殖受到抑制六、酶的作用机理（一）与酶高效率有关的因素1、邻近效应与定向效应（proximityandorientationeffect）化学反应速度于底物浓度成正比底物分子进入活性中心区域，提高活性中心区域的底物有效浓度双羧酸单苯基酯受羧基催化酸酐邻近效应：指两个反应的分子，它们反应的基团需要互相靠近，才能反应。定向效应:指酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确向。2、张力效应和底物形变（strainanddistortion）酶和底物的分子构型都会发生变化。（羧肽酶A）3、酸碱催化（acid-basecatalysis）酚吡啶α－羟基吡啶酶蛋白质中集中可以起广义酸碱催化作用的功能基，入氨基、羧基、巯基、酚羟基和咪唑基等4、共价催化（covalentcatalysis）什么是共价催化？共价催化亲电子催化亲核催化底物于酶形成一个反应活性很高的共价中间物，此中间物很容易变成过渡态，因此能大大降低反应活化能（二）某些酶的活性中心及其作用机理1、溶菌酶（Lysozyme）N-乙酰胞壁酸

N-乙酰葡萄糖胺β-1.4糖苷键底物断裂部位D糖环构象由椅式变成半椅式Glu35Asp52酶使底物分子变形广义的酸碱催化2、羧肽酶A（carboxypeptidaseA，CpA）催化C端肽键水解Glu270Arg145Tyr248酶单独存在时:Arg145Tyr248Glu270酶底物复合物:底物诱导后，酶活性中心结构发生了很大的变化Glu270使底物的敏感肽键发生电子张力而易断裂七、别构酶（也称变构酶，allostericenzyme）p413（一）别构酶结构上的特点（二）别构酶性质上的特点（三）别构酶的别构效应（allostericeffect）1、什么是别构效应一般都是寡聚酶当底物或底物以外的分子和别构酶分子上的相应部位非共价结合后，通过酶分子构象的变化影响酶的催化活性反应初v对[S]作图不服从米氏曲线（四）别构酶的作用动力学p4131、正协同效应（positivecooperativeeffect）2、负协同效应（negativecooperativeeffect）3、正协同效应别构酶与米氏酶动力学比较4、负协同效应别构酶与米氏酶动力学比较怎么区分米氏酶与别构酶？Koshland建议用饱和比值（saturationratio,Rs）典型的米氏酶RS=81具有正协同效应的别构酶RS<81具有负协同效应的别构酶RS>81（五）别构酶举例1、大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶（E.coli

aspartatetranscarbamylase,ATCase）（1）ATCase催化的化学反应和ATCase的动力学曲线（2）ATCase活性调节的机理有催化活性的构象无催化活性的构象（六）别构酶调节酶活性的机理1、对称或协同模型（symmetryorconcertedmodel,也称齐变模型、MWC模型）1965年由Monod、Wyman和Changeux提出。该模型的要点:2、序变模型（sequentialmodel，也称KNF模型）1966年由Koshland、Nemethy和Filmer提出。该模型的要点:八、酶的活力测定p3351．选材2．破碎细胞3．抽提4．去核酸、去多糖5．提纯6．保存（一）酶的制备由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意:1．全部操作在低温0～4℃。2．在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。3．在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量β-巯基乙醇。4．在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力。（二）酶活力的测定p338酶活力（enzymeactivity,也称酶活性）酶活力的测定1．测定酶活力时应注意几点（1）应测反应初速度（initialvelocityorinitialspeed）（2）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增加量来表示。（3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。（4）测定酶反应速度时，应使[S]>>[E]。产物浓度[P](t)2．酶活力和比活力表示方式（1）酶活力（enzymeactivity）酶活力的定义酶活力的大小用酶活力单位来表示，简称酶单位（unit,U）酶单位的定义1961年国际酶单位（IU）1972年Katal（简称Kat）单位习惯上沿用的单位如:乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+

乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶的活力可用丙酮酸的增加量表示，也可用340nm光吸收的增加量来表示。（2）酶的比活力（specificactivity，也称比活性）比活力：指每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用U/mg蛋白质来表示，比活力说明酶的纯度。比活力=酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（mg/ml）比活力有时也可用每g或每ml酶含多少个活力单位来表示。（4）分子活性（molecularactivity）（5）催化中心活性（catalyticcenteractivity）在最适底物浓度时，每分钟或每秒钟每分子酶转换底物的分子数。（3）转换数（TNorkcat)在最适底物浓度时，每分钟每分子酶转换底物的分子数。每分钟每一个催化中心所转换底物的分子数。3.酶活力的测定方法P337分光光度法（spectrophotometry）该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。简便、迅速、准确。一个样品可多次测定，有利于动力学研究。可检测到10