《血红蛋白的提取和分离》

血红蛋白的提取和分离了解从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法理解凝胶色谱法的原理和方法1.凝胶色谱法的原理和方法2.样品的预处理、色谱柱填料的处理和色谱柱的装填一、凝胶色谱法1．概念也称作

法，是根据

的大小分离蛋白质的有效方法，凝胶实际上是一些微小的

球体。分配色谱相对分子质量多孔多孔球体多糖类化合物贯穿的通道(2)分离原理：相对分子质量较小的蛋白质容易进入

的通道，路程

，移动速度较慢；

的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程

，移动速度较快。凝胶内部较长相对分子质量较大较短二、缓冲溶液1．作用在一定范围内，缓冲溶液能抵制

对溶液pH的影响，维持

基本不变。2．配制通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节缓冲剂的

就可以制得在

范围内的缓冲液。外界酸和碱pH使用比例不同pH三、电泳1．概念带电粒子在

的作用下发生

的过程。2．原理(1)许多重要的生物大分子，如

、

等都具有

的基团，在一定的pH下，这些基团会带上

或

。(2)在电场的作用下，这些带电分子会向着

移动。(3)电泳利用了待分离样品中各种分子

以及分子本身的

、

的不同，使带电分子产生不同的

，从而实现样品中各种分子的分离。电场迁移多肽核酸可解离正电负电与其所带电荷相反的电极带电性质的差异大小形状迁移速度四、血红蛋白提取和分离1．样品处理及粗分离(1)红细胞的洗涤：目的是去除

。(2)红细胞的释放：在

和

作用下，借助磁力搅拌器的

作用，红细胞破裂释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：离心(以2000r/min速度，离心10min)→观察到试管中的溶液分4层，从上往下依次为：杂蛋白蒸馏水甲苯搅拌第1层：

的甲苯层。第2层：

的沉淀层——

薄层固体。第3层：

的水溶液——

透明液体。第4层：其他杂质的

色沉淀物。将液体用

过滤，除去

，于

中静置片刻后，分出下层的

液体。无色透明脂溶性物质白色血红蛋白红色暗红滤纸脂溶性沉淀层分液漏斗红色透明(4)透析——粗分离。①过程：取1mL的

溶液装入

中，将其放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol·L－1的

中(pH＝

)，透析12h。②原理：透析袋能使

自由进出，而将

保留在袋内。③目的：去除

。血红蛋白透析袋7.0磷酸缓冲液小分子大分子相对分子质量较小的杂质2．凝胶色谱操作——纯化(1)

的制作。(2)凝胶色谱柱的装填：①装柱前要将色谱柱

在支架上。②装柱前需根据色谱柱的

计算所需要的

。③注意色谱柱内不能有

存在，否则重装。(3)样品的

和

：在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况，如果血红蛋白的红色区带

地移

动，说明色谱柱制作成功。凝胶色谱柱垂直固定内体积凝胶量气泡加入洗脱均匀一致3．纯度鉴定——SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳判断

的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定方法中使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。纯化1．读教材P64～66[基础知识]的相关内容，归纳并回答下列问题。(1)观察教材P65图5－13，试从物质大小、运动方式、路程、速度等方面填写下表，以分析总结凝胶色谱法的原理。(2)交流并分析为什么使用缓冲液？提示：生物体内进行的各种化学反应都是在一定的pH下进行的，缓冲液能够抵制外界酸、碱对溶液pH的影响。使用缓冲液是为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内环境相对稳定的pH。(3)为什么电泳能够将不同蛋白质得以分离？提示：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力方向、大小、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。(4)试分析在琼脂糖凝胶电泳法和聚丙烯酰胺凝胶电泳中，决定各种分子在电场中的迁移速度的因素分别是什么？提示：琼脂糖凝胶电泳：各种分子的带电性质差异、分子大小、形状；聚丙烯酰胺凝胶电泳：蛋白质分子大小。2．读教材P66－69[实验操作]相关内容，归纳并回答下列问题：(1)从实验现象观察的角度分析选用哺乳动物的红细胞作为实验材料的原因？提示：哺乳动物的红细胞没有细胞核和细胞器，含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可通过观察颜色非常直观地来判断收集流出液的时期。

(2)运用文字和箭头表示出血红蛋白提取和分离的实验流程。提示：样品处理及粗分离―→凝胶色谱操作(纯化)―→SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(鉴定)。(3)血红蛋白的提取和分离中，将分离出的血红蛋白液进行透析的目的什么？提示：除去样品中分子量较小的杂质或更换样品中的缓冲液。(4)根据哪些指标来判断凝胶色谱柱装填成功？提示：无气泡；加入大分子有色物质后，色带均匀、狭窄、平整。对蛋白质的研究和应用，首先需要获得高纯度的蛋白质。请回答下列问题：(1)蛋白质的提取和分离一般分为四步：______________、________________、________________和纯度鉴定。(2)如果要从红细胞中分离出血红蛋白，实验前取新鲜血液要在采血容器中预先加入柠檬酸钠的目的是________________。(3)血红蛋白的提取又可以细分为：红细胞的洗涤、________________、分离血红蛋白溶液和________________。其中分离血红蛋白溶液时需要用到________________(仪器)分出下层红色透明液体。(4)装填凝胶色谱柱时，要注意色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡必须重新装。这是因为__________________________________。(5)收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。①透析的目的是__________________________________。②透析的原理是__________________________________。(6)通过凝胶色谱法将样品进一步纯化后，最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。①样品纯化的目的是_____________________________。②血红蛋白的特点是_____________________________。这一特点对进行蛋白质的分离的意义：________________________________________________________________。[解析]

(1)蛋白质的提取和分离一般分为样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定四个步骤。(2)柠檬酸钠是一种抗凝剂，能够防止血液凝固。(3)血红蛋白的提取可分为：红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液和透析。其中分离血红蛋白溶液时需要用到分液漏斗分出下层红色透明液体。(4)凝胶色谱柱内产生的气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。(5)收集的血红蛋白溶液在透析袋中进行透析，目的是去除分子量较小的杂质；因为透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内。(6)利用凝胶色谱法进行纯化，目的是将相对分子量较大的杂质蛋白质去除，血红蛋白是有色蛋白，利用凝胶色谱法分离时，可直接通过观察颜色来判断收集洗脱液的时期。[答案]

(1)样品处理粗分离纯化(2)防止血液凝固(3)血红蛋白的释放透析分液漏斗(4