第六章发酵过程控制201909课件

延滞期长短的因素接种材料的生理状态，如果接种物正处于指数生长期，则延滞期可能根本就不出现，微生物在新的培养基中迅速开始生长繁殖，如果接种物在原培养基中已将营养成分消耗殆尽，则要花费较长时间来适应新培养基。培养基的组成和培养条件也可影响延滞期的长短。接种物的浓度对延滞期长短也有一定影响，加大接种浓度可相应缩短延滞期。延滞期长短对发酵结果的影响种子培养基和培养条件必须合适，只有这样才能获得高的产量。接种后延滞期的长短关系到发酵周期的长短，而与产物形成速率和产率并无必然联系。实际生产过程中，为缩短发酵周期、提高设备利用率、提高体积生产率，就必须尽可能地缩短延滞期。解决途径：一是尽量选择处于指数生长期的种子；二是扩大接种量。但是，如果要扩大接种量，又往往需要多级扩大制种，这不仅增加了发酵的复杂程度，又容易造成杂菌污染，故而应从多方面考虑。LogPhase

CellgrowthrateandmetabolicactivityarethehighestNumberofcellsproduced﹥NumberofcellsdyingCellsaremostsusceptibletoadverseenvironmentalfactors(e.g.radiation,antibiotics)

(二)指数生长期对细菌、酵母等单细胞微生物来讲，单位时间内其细胞数目将成倍增加。而对于丝状微生物而言，单位时间内其生物量将加倍。此时，如以细胞数目或生物量的对数对时间作一对数图，将得一直线，因而这一时期称作指数生长期。指数生长期细胞特点细胞保持均恒生长。不断吸收培养基中的营养成分以合成自身物质，并不断向培养基中分泌代谢产物。由于此时培养基中的营养成分远远过量，且积累的代谢产物尚不足以抑制微生物本身的生长繁殖，因而微生物的生长速率不受这些因素的影响，而仅与微生物本身的比生长速率μ及发酵液中的生物量浓度X(g/L)相关。对于单细胞的微生物来说，还可进一步简化为N—培养基中的细胞密度。对于特定的微生物而言，其比生长速率μ只与三个因素有关:限制性营养物质的浓度、最大比生长速率μm、底物相关常数Ks。假定营养物质进入细胞后，立即被利用而不积累，则存在以下关系式：Ks-----底物相关常效，为μ为1/2μm时限制性营养物质的浓度。

μ：菌体的生长比速S：限制性基质浓度Ks：半饱和常数μmax:最大比生长速度单一限制性基质：就是指在培养微生物的营养物中，对微生物的生长起到限制作用的营养物。μMonod研究了基质浓度与生长速度的关系———Monod方程(1949)μ米氏方程:如果各种营养物质均大大过量的话，则μ=μm，这时便是指数生长期。也就是说，处于指数生长期的微生物,其生长繁殖不受营养物质的限制，因而具有最大比生长速率。如果发酵的目的是为了获得微生物菌体的话，则应尽量设法维持指数生长期。

微生物的最大比生长速率在工业上的意义为保证工业发酵的正常周期，要尽可能地使微生物的比生长速率接近其最大值。最大比生长速率不仅与微生物本身的性质有关，也与所消耗的底物以及培养的方式有关。限制微生物生长代谢的并不是发酵液中营养物质的浓度，而是营养物质进入细胞的速度。StationaryPhase

PopulationsizebeginstostabilizeNumberofcellsproduced=NumberofcellsdyingFactorsthatslowdownmicrobialgrowthAccumulationoftoxicwastematerialsAcidicpHofmediaLimitednutrientsInsufficientoxygensupply

(三)稳定期在细胞生长代谢过程中，培养基中的底物不断被消耗，一些对微生物生长代谢有害的物质在不断积累。受此影响，微生物的生长速率和比生长速率就会逐渐下降，直至完全停止，这时就进入稳定期。处于稳定期的生物量增加十分缓慢或基本不变；但微生物细胞的代谢还在旺盛地进行着，细胞的组成物质还在不断变化。当微生物赖以生存的培养基中存在多种营养物质时，微生物将优先利用其易于代谢的营养物质，至其耗用完时，降解利用其他营养物质的酶才能诱导合成或解除抑制。此时，有的细胞开始老化、裂解，形成芽孢，并向培养基中释放出新的碳水化合物和蛋白质等，这些物质可以用来维持生存下来的细胞的缓慢生长。微生物的很多代谢产物，尤其是次级代谢产物，是在进入稳定期后才大量合成和分泌的。DeathorDeclinePhasePopulationsizebeginstodecreaseNumberofcellsdying>NumberofcellsproducedMostofthenutrientsinthemediumhavebeenconsumed

(四)死亡期在死亡期，细胞的营养物质和能源储备已消耗殆尽，不能再维持细胞的生长和代谢，因而细胞开始死亡。在发酵工业生产中．在进入死亡期之前应及时将发酵液放罐处理。MethodsformeasuringmicrobialgrowthMeasurementofthechangesinnumberofcellsormassofpopulation.MeasurementofCellNumbersDirectcellcounts-countingchambersViablecellcounts-platingmethodsMeasurementofCellMass

Dryweight-timeconsumingandnotverysensitive

Turbidimetricmeasures-quick,easyandsensitiveopticaldensitythenumberofmicrobesE.coli,1OD600=~8x108cells/ml浊度光密度26TypesofFermentationProcessBatch,continuousandfedbatchprocessesbatchfedbatchchemostat

BatchcultureThesterilegrowthmediumisinoculatedwiththemicroorganismsandnoadditionalgrowthmediumisadded.Allthenutrientsneededforcellgrowthwillonlybeaddedonceatthebeginningoffermentation.BatchFermentor分批发酵的特点微生物所处的环境是不断变化的可进行少量多品种的发酵生产发生杂菌污染能够很容易终止操作.当运转条件发生变化或需要生产新产品时，易改变处理对策对原料组成要求较粗放分批培养过程中细菌生长曲线：可分为调整期、对数生长期、平衡期和衰亡期四个阶段。研究细胞的代谢和遗传宜采用生长最旺盛的对数生长期细胞。在发酵工业生产中，使用的种子应处于对数生长期，把它们接种到发酵罐新鲜培养基时，几乎不出现调整期，这样可在短时间内获得大量生长旺盛的菌体，有利于缩短生产周期。在研究和生产中，时常需要延长细胞对数生长阶段。高底物浓度？提高底物浓度可以延长微生物的指数生长期，从而提高发酵的设备利用率、容积产量和产物的积累浓度；但过高的底物浓度往往会引起一系列的不利影响，如底物抑制、粘度升高引起的传质效率降低等。尤为严重的是，微生物的许多次级代谢产物的产生，都受高浓度的葡萄糖、碳水化合物以及含氮化合物的降解产物的抑制。分批培养的优缺点优点：操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握缺点：产率低，不适于测定动力学数据AdvantagesOptimumlevelsofproductrecoverySimpleoperationDisadvantages

ThewastageofunusednutrientsLabourandtimelostbetweenbatches二、连续培养技术与在密闭系统中进行的分批培养相反，连续培养是在开放系统中进行的。所谓连续培养，是指以一定的速率向发酵液中添加新鲜培养基的同时，以相同的速率流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定不变，使培养物在近似恒定状态下生长的培养方法。从系统外部予以调整，使菌体维持在衡定生长速度下进行连续生长和发酵。要维持这一衡定的速度，必须使发酵罐中发酵液的稀释度，恰恰等于该微生物的生长速度。大大提高了发酵的生长效率和设备利用率。恒定状态可以有效地延长分批培养中的指数生长期。在恒定的状态下，微生物所处的环境条件，如营养物质浓度、产物浓度、pH值，以及微生物细胞的浓度、比生长速率等可以始终维持不变，甚至还可以根据需要来调节生长速率。连续培养的工艺种类

1．均匀混合的生物反应器在这种反应器中，培养基经搅拌而混合均匀，反应器中的各部分培养基间不存在浓度梯度。这种连续培养装置又可进一步分为恒化器和恒浊器两种。(1)恒化器是一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置。这是一种通过控制某一种营养物的浓度，使其始终成为生长限制因子的条件下达到的，因而可称为外控制式的连续培养装置。在恒化器中，一方面菌体密度会随时间的增长而增高，另一方面，限制生长因子的浓度又会随时间的增长而降低，两者互相作用的结果，出现微生物的生长速率正好与恒速流入的新鲜培养基流速相平衡。这样，既可获得一定生长速率的均一菌体，又可获得虽低于最高菌体产量，却能保持稳定菌体密度的菌体。(2)恒浊器是根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。在这一系统中，当培养基的流速低于微生物生长速度时，菌体密度增高，这时通过光电控制系统的调节，可促使培养液流速加快，反之亦然，并以此来达到恒密度的目的。因此，这类培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的。在恒浊器中的微生物，始终能以最高生长速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度。在生产实践上，为了获得大量菌体或与菌体生长相平行的某些代谢产物如乳酸、乙醇时，都可以利用恒浊器。在恒浊器中，微生物可维持该培养在分批培养时达到的最大生长速率。一般来说，恒浊器较难控制，目前大多数研究工作者都利用恒化器进行连续培养的研究。

Continuousculture

Maintainscellsinlogphaseataconstantbiomassconcentrationforextendedperiods.ItcanbecontrolledintwowaysTurbidostaticcontrol(internallycontrolled)Chemostaticcontrol(externallycontrolled)恒化恒浊TheTurbidostatRegulatestheflowrateofmediathroughvesseltomaintainapredeterminedturbidityMaintainthehighestgrowthrateNolimitingnutrientTheChemostatRateofincomingmedium=rateofremovalofmediumfromvesselMaintaintheexponentialgrowthphaseAnessentialnutrientisinlimitingquantities

2活塞流反应器这是一种不均一的管状反应器，培养基由反应器的一端流入，而从另一端流出。在这种反应器中，没有返混现象，因而，反应器内的培养基呈极化状态，在其不同的部位，营养物的成分、细胞数目、传质效果、氧供应和生产量都不相同。对于这类反应器，在其入口处，加入物料的同时也必须加入微生物细胞。通常是在反应器的出口处装一支路，使细胞返回，也可以来自另一连续培养装置(种子供应系统)。另外，这种反应器常用于固定化菌和固定化细胞所催化的反应，这时就无需再在进料口处加入催化剂。连续培养在生产上的应用还很有限?

①许多方法只能连续运转20一200小时，而工业系统则要求必须能稳定运行500一1000小时以上；②工业生产规模长时间保持无菌状态有一定困难；③连续培养所用培养基的组成要保持相对稳定，这样才能取得最大产量，而工业培养基的组成成分，如玉米浆、蛋白胨和淀粉等，在批与批之间有时会出现较大变化；④当使用高产菌株进行生产时，回复突变可能发生。在连续培养过程中，回复突变的菌株有可能会取代生产菌株而成为优势菌株。

连续发酵优点①高效，它简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等许多单元操作，从而减少了非生产时间和提高了设备的利用率；②自控，便于利用各种仪表进行自动控制；③产品质量较稳定；④生长与代谢产物形成的两种类型节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均匀合理。

连续发酵缺点菌种易于退化。其次是易遭杂菌污染。所谓“连续”是有时间限制的，一般可达数月至一、二年。在连续培养中，营养物的利用率一般亦低于单批培养。

Fed-batchculture

Aproductiontechniquebetweenbatchandcontinuousculture.Duringfermentation,additionalnutrientswillbeaddedinabatchwaytopromotethecellgrowthorproductformationandtoavoidnutrientdeficiency.Fed-BatchFermentorFeedstockvessel(sterile)Pump分批补料培养技术?

所谓分批补料培养技术，就是指在分批培养伊始，投入较低浓度的底物，然后在发酵过程中，当微生物开始消耗底物后，再以某种方式向培养系统中补加一定的物料，使培养基中的底物浓度在较长时间内保持在一定范围内，以维持微生物的生长和产物的形成，并避免不利因素的产生，从而达到提高容积产量、产物浓度和产物得率的目的。二、分批补料培养技术

在传统的分批培养发酵工艺中，所有的物料都是在发酵开始前加入反应器中的。一般来说，微生物生长所需要的营养物质浓度并不十分高，往往在10Ks以上时就可达到最大比生长速率。在此基础上，即使营养物质浓度再进一步提高，比生长速率也不会再增加了。然而，在分批发酵工艺中，低浓度培养基中的营养物质会迅速耗尽，引起微生物过早地从指数生长期向稳定期转变，这样，设备的利用率和产物的积累浓度都不高。AdvantagesLowconcentrationofspecificsubstrates(e.g.carbonsource)Highconcentrationofend-productProvidinglimitinglevelofarequirednutrientforanauxotrophicstrainSomeexamplesProductMassfeedyeastmaltwort、N、P、MgglutamicacidNH3orureacitricacidammoniumnitrogen、glucosemalicacidglucoseamylaseglucose

Q:Usechemostatasbioreactor,theyieldisfarmorethanbatch,butwhybatchcultureisfarmorewidelyusedthancontinuousculture？

1.Secondaryproducts2.Geneticinstability3.Operabilityandreliability

4.MarketeconomicsAdvantages

ThegrowthrateismaintainedatoptimallevelsDisadvantagesLowbiomassandproductconcentrationRelativelypronetobecontaminatedStraindegenerationFed-batchculturewasusedintheproductionofbakers’yeastasearlyas1915.Itwasrecognizedthatanexcessofmalt(麦芽）inthemediumwouldleadtotoohighagrowthrateresultinginanoxygendemandinexcessofthatwhichcouldbemetbytheequipment.Thisresultedinthedevelopmentofanaerobic（厌氧性的）conditionsandtheformationofethanol（乙醇）attheexpenseofbiomassproduction.Thus,theorganismwasgrowninaninitially(最初的）weakmediumtowhichadditionalmediumwasaddedataratelessthanthemaximumrateatwhichtheorganismcoulduseit.Thus,thisprocessfulfilsthecriteria(标准）stipulated（规定）inPirt’skinetic(动力学）descriptionfortheestablishmentofaquasi（类似的）steadystate,thatis,asubstratelimitedcultureandtheuseofafeedrateequivalent（相当）toadilution（稀释）ratelessthanμm.发酵过程的中间补料1、补料的作用A、补充碳源、氮源物质，满足微生物代谢和合成产物所需营养，推迟菌体自溶期，延长产物合成时期。百分之七、八十的发酵生产都是前期长菌体，中后期合成产物。培养基中的营养物质在前期用于菌体生长，到了中后期营养物质己消耗大半，菌体逐渐衰老自溶，不利于产物的大量积累.为了避免这种情况的出现，如果在培养基配制时，采取一次加足所需营养的话，必然造成底物浓度过高带来一系列的不利影响.而采取降低基础培养基浓度，中间补料的工艺，即有利于菌体生长，又有利于产物大量合成。B、调节pH值，改善环境条件某些发酵类型菌体生长和产物合成所需最适pH值不同，或者在菌体生长及产物形成中，使pH值发生了变化、通过补料可以将pH调节到最适值,中间补料还可以使发酵液粘度降低，改善发酵环境，增加溶氧量等。C、补加前体或诱导剂，促进产量提高例如青霉素发酵中，需加入前体苯乙酸或苯乙酰胺，但一次加入过多对菌体有毒害作用。一般加入总量为0.1%，在基础培养基中加入0.07%，其余通过补料加入罐内。D、控制营养缺陷型菌株生长，增加产物积累对于营养缺陷型菌株生长时，需要加入所缺少的营养物质菌体才能生长，但加入料量太多，会产生反馈抑制或终产物阻遏作用，使所需代谢产物很少积累。而加入所需营养物太少，菌体生长量不足，也不利于产物积累。因此，采取补料流加方法，使营养物维持低浓度，满足菌体生长所需营养而又不使过量产生阻抑作用，有利于产物积累。2、补料的原则

A根据发酵类型，首先确定是否需要补料一般根据菌体生长速度，营养利用及产物形成速度的变化及其相互关系，把发酵分为三种类型。类型Ⅰ：菌体生长、糖的消耗和产物合成是平行过程。例如：酒精发酵、酵母菌体培养。xp产物的形成和菌体的生长相偶联这种发酵类型的特点是：微生物的生长和糖的利用与产物合成直接相关连。产物的形成与生长是平行的。产物合成速度与微生物生长速度呈线性关系，而且生长与营养物的消耗成准定量关系。这种类型的产物主要是葡萄糖代谢的初级中间产物，如乙醇发酵就属于此类型。

类型Ⅱ：菌体生长和产物合成分为两个时期，与之相应的糖的消耗也有两个最迅速时期，一个是最高生长时期，另一个是最大产物合成时期，如谷氨酸、赖氨酸发酵及柠檬酸、衣康酸等有机酸发酵均属于这一类型。xp产物的形成和菌体的生长部分偶联生长产物合成半偶联类型，它是介于生长产物合成偶联型与生长产物合成非偶联之间的中间类型，产物的合成存在着与生长相联和不相联两个部分。该类型的动力学产物合成比速率的最高时刻要迟于比生长速率最高时刻的到来。

类型Ⅲ：产物是微生物的次级代谢产物，产物合成是在菌体生长停止与底物被消耗完以后才开始。如青霉素等抗生素发酵和淀粉酶等酶制剂属于这一类型。xp产物的形成和菌体的生长非偶联多数次生代谢产物的发酵属这种类型，如各种抗生素和微生物毒素等物质的生产速率很难与生长相联系。产物合成速度与碳源利用也不存在定量关系。一般产物的合成是在菌体的浓度接近或达到最高之后才开始的，此时比生长速率已不处于最高速率。

哪一种需要进行中间补料？

xxxpB选择适当的补料时期补料时间并不是只根据发酵时间而定，还需要根据培养基利用情况，菌体生长状态及pH变化等综合考虑，适时补料,如谷氨酸发酵中补加尿素的时间要根据发酸过程中pH变化来决定。C掌握补料量最适补料量可以控制菌体增长、底物的消耗和产物合成三者之间的关系，获得更长的生物合成期，得到更多的产品。补料方式：间歇定时一般都是采用间歇定时补加的方式。也有采用定时连续滴加的方式，这样加入的料量均匀，可以避免一次大量补料造成环境突然改变，菌体不适应带来不良后果。总之，补料是控制发酵过程正常进行的一个灵活措施。发酵终点的判断

要判断合理的放罐时间需考虑以下几个因素：1、提高发酵生产率，降低成本发酵生产率是指单位发酵罐容积的小时产率（即发酵指数），通常用Kg产物或单位/m3.h表示。发酵后期虽然还有产物形成，但产物形成的高峰期已过,产物形成量较少，故延长发酵时间总产量虽有增加，但发酵生产率却下降即单位时间的产量增加的少，等于这段时间内消耗的电力、冷却水等所得到的产量下跌，成本相应提高。所以一般掌握在产物合成高峰后一段时间即结束发酵而放罐。2、是否会影响提炼质量提取过程与产品得率(Kg产物/Kg基质)有关、如果发酵过程结束的过早，发酵液中残留的糖，蛋白质等较多，不容易和产物分开，影响提取过程。而放罐太晚罐内菌体开始自溶，菌体内蛋白质等释放出来，造成过滤困难，过滤时间延长，不稳定的产物会分解提取受到干扰，所以要适时放罐。3、放罐前的发酵控制放罐以前要控制补料量。一般在接近放罐前不再补料，如果必须补加时，需要计算好加入量，掌握在放罐前正好达到残留量允许的范围内。放罐以前需要密切注意观察各项指标，如产物量，氨基氮，残糖量，菌体形态(出现孢子与否？菌体是否自溶?)pH值、培养液外观、粘度等。定型产品发酵时间是一定的。

Unit2FermentationControlThesuccessofafermentationprocessishighlydependentonenvironmentalfactorssuchastemperature,pH,anddissolvedoxygenlevels.FermentationControl

SampleAnalysispHDOSugarAmmoniaPhosphateSulphateProductsPrecursorsContaminationPressureprobeLevelprobepHprobeTemp.probeDOprobeAntifoamAcid/BaseCoolingAir/agitationSugar/OilfeedOrganismsexhibitdistinctcardinalgrowthtemperatures-minimal,maximal,optimalTemperatureHotColdC(Minimum)B(Optimum)A(Maximum)TemperatureControlWhy?Microbesbringsaboutfermentationbysecretingcertainenzymeswhichhaveanoptimumtemperatureoratemperaturerange.温度对发酵的影响

1、温度影响反应速率发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。2、温度影响发酵方向

四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四环素，当温度低于30

℃时，这种菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到35℃时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵过程中的温度要严格控制。Anenergybalanceonfermentationyieldsisthefollowingequation:Qacc=Qf+Qag–Qevap–QsurrQacc

——netheataccumulationQf——heatoffermentationQag——heatgeneratedbymechanicalagitationQevap——heatofevaporationQsurr——heatdissipatedtothesurroundings

现在来分析发酵热产生和散失的各因素。

1、生物热Q生物

在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫生物热。微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多一摩尔葡萄糖彻底氧化成CO2和水好氧：产生287.2千焦耳热量，183千焦耳转变为高能化合物104.2千焦以热的形式释放厌氧：产生22.6千焦耳热量，9.6千焦耳转变为高能化合物13千焦以热的形式释放二个例子中转化为高能化合物分别为63.7％和42.6％生物热与发酵类型有关培养过程中生物热的产生具有强烈的时间性。生物热的大小与呼吸作用强弱有关在培养初期，菌体处于适应期，菌数少，呼吸作用缓慢，产生热量较少。菌体在对数生长期时，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌体也较多，所以产生的热量多，温度上升快，必须注意控制温度。培养后期，菌体已基本上停止繁殖，主要靠菌体内的酶系进行代谢作用，产生热量不多，温度变化不大，且逐渐减弱。如果培养前期温度上升缓慢，说明菌体代谢缓慢，发酵不正常。如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染菌，此外培养基营养越丰富，生物热也越大。2、搅拌热Q搅拌

在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生可观的热量。搅拌热与搅拌轴功率有关，可用下式计算：Q搅拌＝P×860×4186.8（焦耳/小时）P——搅拌轴功率4186.8——机械能转变为热能的热功当量3、蒸发热Q蒸发

通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的热量叫蒸发热。此外，排气也会带走部分热量叫显热Q显热，显热很小，一般可以忽略不计。4、辐射热Q辐射发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。辐射热的大小取决于罐温与环境的温差。冬天大一些，夏天小一些，一般不超过发酵热的5％。Q发酵＝Q生物＋Q搅拌－Q蒸发－Q辐射（二）发酵热的测定有二种发酵热测定的方法。一种是用冷却水进出口温度差计算发酵热。在工厂里，可以通过测量冷却水进出口的水温，再从水表上得知每小时冷却水流量来计算发酵热。Q发酵＝GCm(T出－T进)Cm——水的比热G——冷却水流量另一种是根据罐温上升速率来计算。先自控，让发酵液达到某一温度，然后停止加热或冷却，使罐温自然上升或下降，根据罐温变化的速率计算出发酵热。

Temp.controlmethodsCoolingwater

incoolingjacketorcoilSterilization-steamRefrigeratororfreezerQ:Usually,optimumgrowthtemperatureisdifferencewithoptimumproductiontemperature,howwouldyoudo?AnswerTemperature-shiftingfermentation三、最适温度的选择1、根据菌种及生长阶段选择微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。如黑曲霉生长温度为37℃，谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30℃～32℃，青霉菌生长温度为30℃。根据生长阶段选择在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。如四环素生长阶段28℃，合成期26℃后期再升温；黑曲霉生长37℃，产糖化酶32～34℃。但也有的菌种产物形成比生长温度高。如谷氨酸产生菌生长30～32℃，产酸34～37℃。最适温度选择要根据菌种与发酵阶段做试验。根据模拟计算机对发酵温度最佳点的计算，得到青霉素发酵的最适温度是起初5小时维持在30℃；随后降到25℃，培养35个小时；再降到20℃培养85小时；最后回升到25℃培养40小时放罐。采用这种变温培养，在该试验条件下比25℃恒温培养所得青霉素产量高14.7％。2、根据培养条件选择温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。3、根据菌生长情况菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。pHcontrol

MostmicroorganismshavenarrowpHgrowthranges(pH5-7)ThebufferinginculturemediaisgenerallylowMetaboliteswhichreleasedintothemediumcanchangethepHpH是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。发酵过程中pH是不断变化的，通过观察pH变化规律可以了解发酵的正常与否一、发酵过程pH变化的原因

1、基质代谢

（1）糖代谢特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一（2）氮代谢当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降。（3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降2、产物形成

某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。

3、菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升。

二、pH对微生物生长和发酵的影响

（1）pH影响酶的活性。A．不同pH环境条件下，菌体内酶系不同。E.coli在pH4.5-9.0范围内都能生长。对体内酶的形成却有影响，pH4时体内形成氨基酸脱羧酶，pH8时，体内形成氨基酸脱氨酶。B．不同pH影响已形成酶的活性。pH不同，体内酶促反应不同，代谢产物不一样，例如，黑曲霉作为柠檬酸产生菌，pH2-3时生成柠檬酸，pH3.0以上产生草酸，pH5.0时葡萄糖氧化酶活力高，容易生成葡萄糖酸。酵母菌在pH4.5-5.0时产生酒精。pH8.0时二分子乙醛进行歧化反应，生成乙酸、乙醇，同时产生甘油（三型发酵）。pH变化引起酶活力变化，可能是由于酶、底物或酶——底物络合物的电离情况发生变化而造成的。（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行。

原生质膜由40%磷脂和60%蛋白质构成，具有胶体性质，在一定pH值内带正电荷；在另一种pH值内则带负电荷，当环境pH值改变，会使原生质膜荷电性改变，引起原生质膜对个别离子渗透性的变化，影响某些物质的吸收和代谢物排泄，影响新陈代谢正常进行。（3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用一般物质在水中以解离状态而溶解，当pH值发生改变时，物质解离度发生改变，培养基或一些中间产物解离状态受到影响，不利于菌体吸收利用。例如培养基中的有机化合物，在酸性pH中不解离，不离子化的物质能够渗入带有负电荷的细胞，而在中性或碱性pH条件下呈离子化状态，带有负电荷的物质，不能渗入带负电荷的细胞内。微生物代谢中产生CO2，在水中溶解生成H2CO3（碳酸），它可以离解为H+和CO32-。pH5以下CO2溶解度降低，水中CO2减少，Mg2+、Ca2+、Mo2+等离子溶解度增大，浓度增大达到对机体有害水平,pH6以上，CO2溶解度增大，Fe2+、Mg2+、Ca2+等溶解度下降，通常以碳酸盐、氢氧化物或磷酸盐形式沉降下来。（4）pH影响代谢方向

pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。例如黑曲霉在pH2~3时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生草酸。谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺与（1）pH影响酶的活性相关此外，发酵中pH变化还会引起ATP生产率减少，使细胞产量减少，代时增加，如葡萄糖酒精发酵，pH从7.2—5.0，每100mmol葡萄糖形成ATP从220mmol，菌体量从2.58g-1.77g，代时从2h-4h。pH还影响培养基的氧化还原电位（用Eh表示，代表氧化剂和还原剂的相对强度，（伏特计），pH值低，氧化还原电位高，pH值高，氧化还原电位低，在许多氧化还原系统中，每降低一个pH值Eh值增加0.06伏特，一般好气微生物只能在Eh较高的培养基中生长，相反，厌氧微生物需在氧化还原低的培养条件中生长，Eh发生改变菌体将不能正常生活。

pH还会影响菌体形态，例如青霉菌在pH6.0时菌丝缩短，pH大于7.0时细胞呈膨胀状态，细胞壁强度下降，不能忍受内部渗透压力，易于破裂，说明壁的结构成分的合成受pH影响。三、pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响

生长合成pH对菌体生长影响比产物合成影响小例青霉素：菌体生长最适pH3.5~6.0,产物合成最适pH7.2~7.4四环素：菌体生长最适pH6.0~6.8，产物合成最适pH5.8~6.0XpH四环素四、发酵过程中pH值的变化情况

发酵过程中pH变化，主要是由于菌体代谢作用，使加入培养基内物质变化结果，另外，产物形成引起pH变化。在发酵过程中，随着微生物的生长及产物合成不同时期，pH发生不同变化，有些变化符合微生物自身的需要，不需调节。有的变化，则必须进行调节，达到最适，以利于微生物代谢，形成更多产物，引起pH变化有两种情况：一种情况是微生物代谢过程中产生酸性或碱性产物，使pH下降或上升；另一种情况是培养基中加入酸、碱性物质被利用后，引起pH变化。

属于前一种情况的如：1.糖、脂肪代谢过程中，通气不足，氧化不完全，糖中间代谢产物有机酸积累，脂肪酸的积累使pH下降，（如通气条件良好，彻底氧化生成CO2和H20）。在蛋白质（氨基酸）被分解中，当脱氨酶活性高，氨被分解利用后生成酸使pH降低。反之，若菌体内脱羧酶活性高，蛋白质分解放出CO2，生成碱性胺，使pH上升。一般培养基C/N比高（含C较多），则发酵倾向于酸性。反之，多偏向于碱性。不同物质被菌体分解速度不一样，引起pH变化也不同，如灰黄霉素发酵以乳糖作基础培养基的碳源，利用缓慢，丙酮酸积累少，pH能维持在6——7之间，有利于产物合成，如果以葡萄糖作碳源，丙酮酸迅速积累，pH下降到3.5，灰黄霉素产量极低。2.生理酸性盐和生理碱性盐的影响。

铵盐、常用的硫酸盐，当被利用后，剩下硫酸根使pH下降，NH3被利用，SO42-留下，生理碱性盐，如NaNO3,KNO3。在柠檬酸发酵中随着培养液中糖被转换成柠檬酸，pH下降。五、最佳pH的确定配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况pH对产海藻酸裂解酶的影响pH对海藻糖水解酶产生的影响pH——菌浓

pH——酶活pH对谷氨酰胺转氨酶活力的影响HowtomaintainoptimumpH?Additionofbase(NaOH)oracid(HCl)Additionofphysiologicalacidsubstance((NH4)2SO4)orphysiologicalalkalisubstance(ammoniumhydroxide)六、pH的控制

1、调节好基础料的pH。基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要调到6.5~6.82、在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等3、通过补料调节pH，在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH。4、当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH。pH?残糖量/残氮?菌丝浓度?A：pH偏高，残糖量不高，菌丝浓度不稠，可以加葡萄糖使pH降低。B：pH高，残糖量高，菌丝浓度不稠，添加玉米浆或硫铵。玉米浆中氨基酸脱氨基后剩下有机酸，使pH降低。C：pH低，残氨量不高，菌丝不稠，加氨水或尿素调节。D：pH低，菌丝浓度较稠，加CaCO3，既使pH上升，又不使菌丝过多生长。一般当菌丝较老、较小时，可用营养物质调节，而当菌丝多，菌龄小时，不适于用营养物质调节。pH控制是一项非常细致的工作，不仅考虑最佳pH值，而且要根据生长阶段考察对pH的要求。在pH控制中还要采用合适的调节方法。总结1、Howtogetanidealstrainforfermentationindustry?2、DEvalue3、简述淀粉酶水解过程4、Comparethethreemethodstoproduceglucosefromstarch。Q:Inmanyfermentationfactories,ureaorammoniawaterisoftenusedasafed-batchsubstance,what’sthefunctionofit?AdjustingpHofmediaUsingasanitrogensource

Dissolvedoxygen(DO）Control

MostindustrialfermentationsareaerobicprocessesSupplyingoxygentoaerobiccells

hasaproblem：oxygenispoorlysolubleinwater(8mg/Lat4oC,sucroseissolubleto600g/L)Oxygensupplyingistheratelimitingstepinanaerobicfermentation

溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往最易成为限制因素。一、微生物对氧的需求

1、描述微生物需氧的物理量比耗氧速度或呼吸强度（QO2）：单位时间内单位重量的细胞所消耗的氧气，mmolO2·g菌-1·h-1

摄氧率(r)：单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。mmolO2·L-1·h-1。r=QO2.XX：发酵液中菌体浓度（g/L）

2、溶解氧浓度对菌体生长和产物形成的影响CCr（C临界）:

临界溶氧浓度,指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度，单位为每升发酵液中氧的mmol数，即mmolO2/L。。QO2CLCCr一般对于微生物：CCr:

＝1～15%饱和浓度例：酵母4.6*10-3mmol.L-1,1.8%产黄青霉2.2*10-2mmol.L-1,8.8%定义：氧饱和度＝发酵液中氧的浓度/临界溶氧浓度所以对于微生物生长，只要控制发酵过程中氧饱和度>1.Theminimumconcentrationofoxygenwhichhasbeensubmergedinwater,whereoxygenisthelimitingfactortothegrowthofthemicrobes.Criticaldissolvedoxygenconcentration3、影响需氧的因素r=QO2.X菌体浓度QO2遗传因素菌龄营养的成分与浓度有害物质的积累培养条件二、反应器中氧的传递1、发酵液中氧的传递方程CCiPPi气膜液膜N=Kg（P-Pi）=Kl（Ci-C）N：传氧速率kmol/m2.hkg:气膜传质系数kmol/m2.h.atmKl:液膜传质系数m/h双膜理论建立在假设之上C*＝P/H,与气相中氧分压相平衡的液体中氧的浓度KL:以氧浓度为推动力的总传递系数(m/h)再令：单位体积的液体中所具有的氧的传递面积为a(m2/m3)Nv：体积传氧速率kmol/m3.hKLa:以(C*-C)为推动力的体积溶氧系数，h-1

反映了设备的供氧能力

Nv＝KLa

(C*-C)

N＝KL

(C*-C)2、发酵液中氧的平衡发酵液中供氧和需氧始终处于一个动态的平衡中传递：消耗：r=QO2.X氧的平衡最终反映在发酵液中氧的浓度上面Nv＝r

Nv＝KLa

(C*-C)Theobjectiveistomaintaintheoptimaldissolvedoxygenconcentrationaboveacriticalconcentrationtoavoidinhibitionofthecellgrowthrateduetolackofoxygen.发酵过程的控制一般策略：前期有利于菌体生长，中后期有利于产物的合成溶氧控制的一般策略：前期大于临界溶氧浓度，中后期满足产物的形成。三、发酵过程中溶氧的控制1、供氧的调节C有一定的工艺要求，所以可以通过KLa和C*来调节其中C*＝P/HNvHPKLa

Nv＝KLa

(C*-C)调节KLa是最常用的方法，KLa反映了设备的供氧能力，一般来讲大罐比小罐要好。

45升1吨10吨搅拌速度250rpm120120供氧速率7.610.720.1A、改变通气速率其作用是增加液体中夹持气体体积的平均成分。但在常速搅拌下增加通气速率以提高氧传递速率是一种递减性的，即当气流速度越大，再增加其速度对氧的溶解度的提高作用越小。并且当系统被气流引起液泛时，传质速率会显著下降，使泡沫增多，罐的有效利用率减小。故还是采用控制搅拌效果较佳。增加搅拌的重要作用在于改善罐内液体的混合和循环，从而具有抑制气泡聚合的效果。并且液相的良好混合可避免低于平均氧浓度的“死角”的存在。B、改变搅拌转速a、把从空气管道引入发酵罐的空气打成细泡，增加气液接触面积“a”，也即增加氧的传递面积；

b、使液体形成涡流，从而延长气泡在液体中的停留时间；c、增加液体的湍流程度，降低气泡周围的液膜阻力和液体主流中的流体阻力，从而增大KLa值。d、减少菌丝结团现象。降低细胞壁表面的液膜阻力，改善细胞对氧和营养物质的吸收，同时降低细胞周围的“废物‘和“废气”的浓度，有利于微生物的代谢.但是过高的搅拌速度不但浪费动力，还会损伤菌体，引起自溶和造成减产等。实际上：对于转速的调节有时是有限度的通风的增加也是有限的蒸发量大中间挥发性代谢产物带走2、需氧的调节菌的需氧量以下式表示：r=QO2.X养料的丰富程度：营养丰富，浓度高，菌体生长快，耗氧量大。温度的影响：在最适条件下发酵，耗氧快发酵液的理化性质传氧中间介质的加入3、溶氧控制的实例GAXDO谷氨酸发酵：要求：氧饱和度>1控制：0-12小时小通风12小时后增加通风原因：0-12小时菌体量较小，采用小通风12

一般