野生冬虫夏草、人工冬虫夏草蛋白质组分析

野生冬虫夏草、人工冬虫夏草蛋白质组分析1975年，意大利生化学家O'Farell建立了经典的2-DE技术，并首次成功用于分离约1000个大肠杆菌、老鼠及几尼猪的蛋白质斑点，但蛋白质谱不稳定，易随环境而变化[61]。经过近40年的发展，伴随着如固相pH

梯度凝胶电泳,

差异凝胶电泳,

质谱技术等的建立与完善，2-DE技术已日趋成熟，是目前唯一可以在一块凝胶上同时分离上万个蛋白质的方法，且分离纯度可达90%以上。2007年，Wang

等[62]采用蛋白质组学技术从分子水平考察复方双丹（丹参和丹皮）煎剂抗大鼠急性心肌梗死的作用机制，运用2-DE和MALDI-TOFMS结合技术分离和鉴定了23个差异蛋白，这些蛋白分别与能量代谢、氧化应激和细胞骨架有关，从而整体阐述了双丹煎剂通过调节心肌能量代谢、抗氧化应激损伤等多途径发挥抗心肌梗死的作用。Qi[63]等运用蛋白质组学研究桃红四物汤对氧糖剥夺脑缺血再灌注损伤PC12细胞凋亡的保护机制，采用2-DE结合MALDI-TOFMS

分析了26个与桃红四物汤调控作用相关的蛋白质，并鉴定这些蛋白参与多种重要的生化过程，具有不同的生理功能。本研究应用双向电泳技术对野生冬虫夏草整体、菌虫复合体、子座及人工冬虫夏草整体、菌虫复合体、子座的蛋白质组进行分析，筛选出野生冬虫夏草及人工冬虫夏草差异性蛋白质，验证前期冬虫夏草指标性蛋白质并在蛋白质层面揭示了野生冬虫夏草与人工培育冬虫夏草的差异，为鉴别野生、人工冬虫夏草提供资料。1仪器与材料1.1仪器低温高速离心机：贝克曼X-22R型双向电泳系统：Bio-Rad公司凝胶扫描成像系统：

Bio-Rad公司电热恒温鼓风干燥箱：上海岛韩实业公司DHG-9035A型1.2试剂聚丙烯酰胺预混液、甘氨酸、BSA（纯度≥99%）、Tris碱、CHAPS、碘乙酰胺、TEMED、SDS、尿素、过硫酸铵、覆盖琼脂糖、QuickStart™Bradford1x

DyeReagent、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、IPG胶条(17cm,pH3-10)、Bio-Lyte

(pH3-10)、DTT、PrecisionPlusProtein™

预染标准品、矿物油均购自Bio-Rad公司；PMS、APS、考马斯亮蓝R-250、低熔点琼脂糖、溴酚蓝、-巯基乙醇、Tween-80、购自鹏程生物科技有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、TCA、丙酮、甲醇、冰乙酸购自成都科龙化工试剂厂，均为分析纯；水为去离子水。1.3主要试剂配置PBS缓冲液(0.02mol/L，pH=7.2)：5.16gNa2HPO4，0.87gNaH2PO4，超纯水溶解定容至100mL。蛋白质提取液：PBS缓冲液(0.02mol/L，pH=7.2)，0.2%Tween80，0.2%β-巯基乙醇，1mMPMSF。10%TCA-丙酮：20gTCA，0.14gDTT，加丙酮溶解，定容至200mL，-20℃预冷。10%SDS：10gSDS，少量超纯水加热溶解，定容至100mL，混匀，室温保存。10%APS：0.1gAPS，用时加入1mL超纯水溶解，4℃保存。10×电泳缓冲液(10×=25mMTris,192mM

甘氨酸，0.1%SDS,pH8.3)：30gTris碱，144g甘氨酸，10gSDS，适量超纯水溶解，定容至1000mL，混匀后室温保存。胶条平衡缓冲液母液：72g尿素，4gSDS，适量超纯水溶解，加入50mL

Tris-HCl(1.5MpH8.8Tris-HCl)，20mL甘油，定容至100mL。分装，-20℃保存。水化上样缓冲液：4.2g尿素，1.52g硫脲，0.4gCHAPS，0.098gDTT，适量超纯水溶解，加入50L40%Bio-Lyte，10L溴酚蓝(1%)，超纯水定容至10mL。分装，-20℃保存。胶条平衡缓冲液I：0.2gDTT，10mL胶条平衡缓冲液母液，充分混匀，用时现配。胶条平衡缓冲液II：0.2g碘乙酰胺，10mL胶条平衡缓冲液母液，充分混匀，用时现配。1.4药材野生冬虫夏草、人工冬虫夏草样品2017年采自四川省阿坝州小金县经成都中医药大学国锦琳教授鉴定为小金县野生冬虫夏草、人工冬虫夏草，留样标本存放于成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室。2方法2.1蛋白质提取2.1.1蛋白质的提取取样品粉末约0.2g，加入液氮适量，加入0.02mol•L-1PBS

缓冲液(pH7.2)

5mL(1%PMSF)，充分研磨至糊状，4℃浸提过夜。取出离心，4℃，13000rpm，30min，重复离心，收集上清液。2.1.2蛋白质的保存将2.1.1得到的上清液用Bradford法[27]测定其含量，用0.22微米的膜除菌，无菌分装于0.5mLEP中，进行标记，置4oC保存备用。2.2蛋白质含量测定2.2.1标准曲线制备配制BSA标准溶液(1mg•mL-1)，按下表制作蛋白质定量标准曲线，用紫外分光光度计检测OD595并记录。表7.Bradford法蛋白质定量标准曲线的制备Table7.Preparationofastandardcurveforproteinquantification图23

Bradford法测定冬虫夏草蛋白含量标准曲线

Figure.23StandardcurveofOphiocordycepssinensisproteincontentdeterminedbyBradfordmethod2.2.2样品含量测定取2.1.1项下蛋白粗提液50uL，采用2.2.1项进行蛋白质含量测定。2.3蛋白质纯化（TCA-丙酮沉淀蛋白[28]）取2.1.1项下蛋白粗提取液，加入10倍体积TCA-丙酮(10%TCA,0.07%DTT)，漩涡混合后于-20℃静置1h，离心，10min，13000rpm，弃去上清液；加入-20℃预冷丙酮洗涤4次，室温自然干燥后水化上样缓冲液溶解，低温震摇1h，离心取上清液，再次离心，取上清液保存备用。2.4双向电泳凝胶[28][29]采用2.3.1项蛋白质样品，上样量为600ug。第一向不搭盐桥的方式进行水化，设置水化温度20℃，被动水化12~16h。第二向SDS参照郭尧君[30]方法，凝胶浓度12%T，电泳过程起始采用低电流10mA/gel，一小时后改变电流为30mA/gel，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时停止电泳。2.5染色电泳结束后采用考马斯亮蓝法（0.1%考马斯亮蓝R250，45%甲醇，10%冰乙酸）染色，过夜，脱色液（10%甲醇，10%冰乙酸）摇床脱色至背景脱色干净。2.6凝胶扫描及图像分析用ImagescanerII透射扫描仪对凝胶进行扫描，分辨率为150dpi，保存图像。使用PDQUESTTMBasic(Bio-Rad)和SPSS进行图像和数据的处理分析。3结果3.1蛋白质含量分析表8

不同来源冬虫夏草蛋白质含量(n=3)Table8.ProteincontentofOphiocordycepssinensisfromdifferentsources(n=3)P>0.053.3冬虫夏草共有斑点验证课题组前期得到冬虫夏草共有蛋白质88个[29]，本研究利用PDQUET软件对该88个蛋白质点进行验证样。验证得到：野生冬虫夏草整体中存在共有蛋白质70个，野生冬虫夏草子座中存在共有蛋白质60个，野生冬虫夏草菌虫复合体存在共有蛋白质67个；人工虫草整体中存在共有蛋白质59个，人工虫草子座中存在共有蛋白质53个，人工虫草菌虫复合体存在共有蛋白质54个。如图24-30。图24.课题组前期鉴定88个冬虫夏草共有蛋白Figure24.Thestudygroupidentified88commonproteinsofOphiocordycepssinensisinearlystage图25.野生冬虫夏草验证得到70个共有蛋白质Figure25.WildOphiocordycepssinensishasbeenverifiedtohave70proteins图26.野生冬虫夏草子座验证得到60个共有蛋白质Figure26.WildOphiocordycepssinensisstromahasbeenverifiedtohave60proteins图27.野生冬虫夏草菌虫复合体验证得到67个共有蛋白质Figure27.MycoticcomplexofwildOphiocordycepssinensishasbeenverifiedtohave67proteins图28.人工虫草验证得到59个共有蛋白质Figure28.ArtificialOphiocordycepssinensishasbeenverifiedtohave59proteins3.4冬虫夏草及伪品差异斑点验证利用PDQUET软件对冬虫夏草与伪品的电泳图谱对比分析，对课题组前期实验得到的26个冬虫夏草正伪品指标性蛋白进行验证。实验发现，野生冬虫夏草蛋白斑点550个，人工冬虫夏草蛋白斑点364个，相同样本蛋白图谱匹配率为57%~89%，验证得到：野生冬虫夏草23个正伪品差异蛋白，子座19个正伪品差异斑点，菌虫复合体22个正伪品差异斑点；人工冬虫夏草20个正伪品差异斑点，子座14个正伪品差异斑点，菌虫复合体18个正伪品差异斑点。见图31-37。图31.前期课题组鉴定正伪品26个差异蛋白Figure31.Earlyidentificationof26authenticityproductsinthestudygroup图32.野生冬虫夏草验证得到23个差异蛋白Figure32.Verificationof23differentialproteinsbywildOphiocordycepssinensis图33.野生冬虫夏草子座验证得到19个差异蛋白Figure33.Verificationof19differentialproteinsbystromaofOphiocordycepssinensis图34.野生冬虫夏草菌虫复合体验证得到22个差异蛋白Figure34.Verificationof22differentialproteinsbymycoticcomplexofwildOphiocordycepssinensis图35.人工冬虫夏草验证得到20个差异蛋白

Figure35.Verificationof20differentialproteinsbyartificialOphiocordycepssinensis3.5差异蛋白斑点软件分析3.5.1人工冬虫夏草与野生冬虫夏草差异蛋白分析利用PDQUESTTMBasic软件对冬虫夏草图谱进行匹配分析后，建立冬虫夏草共有蛋白凝胶作为参照胶，分别对人工虫草图谱为分析胶进行组间匹配，进行差异表达分析经过分析后得到感光度sensity=3.0的差异表达蛋白点。结果显示，在野生冬虫夏草与人工冬虫夏草的对比分析中，仅存在野生冬虫夏草中的差异表达蛋白25个，如图38；仅存在于人工冬虫夏草中的差异表达蛋白2个，表达量明显差异的蛋白3个，如图39。这些差异蛋白多分布在15kD~30kD的范围内，多为酸性蛋白。图38.野生冬虫夏草与人工冬虫夏草差异表达蛋白Figure38.ProteinsdifferentiallyexpressedbetweenwildOphiocordycepssinensisandartificialOphiocordycepssinensis图39.仅在人工冬虫夏草中存在的蛋白及含量明显减少的蛋白Figure39.ProteinsfoundinartificialOphiocordycepssinensisonlyandproteinswithsignificantlyreducedlevels3.5.2人工冬虫夏草菌虫复合体与野生冬虫夏草菌虫复合体差异蛋白分析利用PDQUESTTMBasic软件对冬虫夏草虫体图谱进行匹配分析后，建立冬虫夏草菌虫复合体共有蛋白凝胶作为参照胶，对人工虫草菌虫复合体部分图谱为分析胶进行组间匹配，进行差异表达分析经过分析后得到感光度sensity=3.0的差异表达蛋白点。结果显示，在野生冬虫夏草菌虫复合体与人工冬虫夏草菌虫复合体部分的对比分析中，仅存在于野生冬虫夏草菌虫复合体中的差异表达的蛋白30个，如图40；仅存在于人工冬虫夏草菌虫复合体部分的差异蛋白4个，如图41。这些差异蛋白多分布在30kD~75kD的范围内，多为中性及碱性蛋白。图41.仅在人工冬虫夏草菌虫复合体中存在的蛋白Figure41.ProteinsfoundonlyinthemycoticcomplexofartificialOphiocordycepssinensis图40.仅在野生冬虫夏草虫体中存在的蛋白Figure40.ProteinsfoundonlyinwildOphiocordycepssinensis3.5.3人工冬虫夏草子座与野生冬虫夏草子座差异蛋白分析利用PDQUESTTMBasic软件对冬虫夏草子座图谱进行匹配分析后，建立冬虫夏草子座共有蛋白凝胶作为参照胶，对人工虫草子座图谱为分析胶进行组间匹配，进行差异表达分析经过分析后得到感光度sensity=3.0的差异表达蛋白点。结果显示，在野生冬虫夏草子座与人工冬虫夏草子座部分的对比分析中，仅存在于野生冬虫夏草子座中的差异表达蛋白22个，如图42；仅存在于人工冬虫夏草子座部分的差异表达蛋白4个，如图43。图谱显示，这些差异蛋白多分布在25kD~50kD的范围内，多为酸性蛋白。图42.仅在野生冬虫夏草子座中存在的蛋白

Figure42.ProteinsfoundonlyinwildOphiocordycepssinensis图43.仅在人工冬虫夏草子座中存在的蛋白Figure43.ProteinsfoundonlyinartificialOphiocordycepssinensis4小结本部分研究通过2-DE技术，获得了野生冬虫夏草、人工冬虫夏草及其菌虫

复合体、子座的蛋白质表达图谱。图谱分析发现野生冬虫夏草与人工冬虫夏草蛋白质均具有良好的多样性，蛋白质种类丰富；野生冬虫夏草与人工冬虫夏草蛋白质斑点分布模式相似，表明蛋白质在冬虫夏草种内表达稳定。5讨论5.1蛋白质含量及斑点数分析本部分研究采用Bradford法测定蛋白质含量，分析发现野生冬虫夏草及其菌虫复合体、子座蛋白质含量均高于人工冬虫夏草，同时图像对比分析发现，野生冬虫夏草及其菌虫复合体、子座蛋白质斑点数量也远高于人工冬虫夏草。表明了环境对冬虫夏草的生长发育具有正向的影响。同时也说明了人工冬虫夏草样品蛋白质种类的多样性不及野生冬虫夏草样品。5.2冬虫夏草共有蛋白质验证前期课题组通过双向电泳技术(2-DE)得到冬虫夏草共有蛋白质斑点88个[29]。本研究在此基础上，对野生冬虫夏草整体、菌虫复合体、子座及人工冬虫夏草整体、子座、菌虫复合体进行2-DE分析，建立蛋白质双向电泳图谱，使用PDQUEST对其进行图像分析，验证得到：野生冬虫夏草中存在共有蛋白质70个，野生冬虫夏草子座中存在共有蛋白质60个，野生冬虫夏草菌虫复合体存在共有蛋白质67

个；人工虫草中存在共有蛋白质59个，人工虫草子座中存在共有蛋白质53个，人工虫草菌虫复合体存在共有蛋白质54个。野生冬虫夏草样品中共有斑点均多于人工样品。5.3前期冬虫夏草与混伪品差异斑点验证前期课题组通过双向电泳技术(2-DE)得到冬虫夏草指标性蛋白质斑点26个[28]。本研究在前期课题组基础上，对野生冬虫夏草整体、菌虫复合体、子座及人工冬虫夏草整体、菌虫复合体、子座进行2-DE分析，建立蛋白质双向电泳图谱，PDQUEST对其进行图像分析，验证得到野生冬虫夏草23个指标性蛋白质、野生冬虫夏草菌虫复合体22个指标性蛋白质、野生冬虫夏草子座19个指标性蛋白质、人工冬虫夏草20个指标性蛋白质、人工冬虫夏草菌虫复合体18个指标性蛋白质、人工冬虫夏草子座14个指标性蛋白质。野生冬虫夏草各样品中混伪品指标性蛋白质均多于人工冬虫夏草。证实了实验所用人工冬虫夏草样品与伪品具有明显差异，并能够从蛋白质组层面分辨。5.42-DE图像分析本部分试验在前期方法的基础上，获得质量较高的2-DE图谱。2-DE图谱分析结果显示冬虫夏草各样品蛋白质较丰富，在分子质量10-90kDa范围内普遍分布，多样性良好。5.4.1人工冬虫夏草与野生冬虫夏草差异蛋白分析蛋白质含量上，野生冬虫夏草样品蛋白质含量为0.65%，人工冬虫夏草样品为0.57%；蛋白质种类上，两种冬虫夏草样品均显示出良好的多样性，但图谱显示野生冬虫夏草样品蛋白质斑点数为550，人工冬虫夏草样品为364，差异蛋白多分布在15kD-30kD的范围内，多为酸性蛋白。5.4.2人工冬虫夏草菌虫复合体与野生冬虫夏草菌虫复合体差异蛋白分析蛋白质含量上，野生冬虫夏草菌虫复合体样品蛋白质含量为0.78%，人工冬虫夏草菌虫复合体样品为0.67%；蛋白质种类上，两种菌虫复合体样品均显示出良好的多样性，但图谱显示野生菌虫复合体样品蛋白质斑点数为468，人工菌虫复合体样品为379，差异蛋白多分布在30kD-75kD的范围内，中性及碱性蛋白占多数。5.4.3人工冬虫夏草子座与野生冬虫夏草子座差异蛋白分析蛋白质含量上，野生冬虫夏草子座样品蛋白质含量为0.86%，人工冬虫夏草样品为0.54%；蛋白质种类上，两种冬虫夏草子座样品均显示出良好的多样性，但图谱显示野生子座样品蛋白质斑点数为535，人工冬虫夏草样品为300，差异蛋白多分布在25kD-50kD的范围内，多为酸性蛋白。综上所述，野生冬虫夏草及其菌虫复合体、子座虽然与人工冬虫夏草2-DE

图谱相似，具有相似的蛋白质成分表达，但各部分蛋白质含量与蛋白斑点数均高于人工品，差异蛋白主要集中在15kD-75kD的范围内，且多为酸性蛋白。其中差异最大的是子座部分。蛋白质含量上野生冬虫夏草子座比人工冬虫夏草子座高出约0.3%，蛋白质种类上，野生冬虫夏草子座比人工冬虫夏草子座多出近200种蛋白质。提示在冬虫夏草菌侵染小金蝠蛾幼虫的过程中，环境因子对冬虫夏草内在化学成分表达呈正向的影响揭示了蛋白质层面。表明了野生冬虫夏草蛋白质含量更高，多样性更丰富，远优于人工冬虫夏草。全文结论本课题基于蛋白组与转录组，以揭示冬虫夏草生长发育过程中遗传、生理、生化等特征的变化为目的，进行了以下工作：1.

本实验利用IlluminaHiSeq2500对人工培育冬虫夏草子实体、菌丝体及小金蝠蛾幼虫转录组进行分析，发现冬虫夏草菌丝体、子实体和冬虫夏草具有高同源性，而小金蝠蛾幼虫与其他样品的同源性很低；发现4个sod-1基因MSTRG.2218，MSTRG.5467，MSTRG.5954和MSTRG.69514在子实体中的表达水平上调，表明这4个sod-1基因与子实体的发育相关；肌动蛋白基因MSTRG.3317的表达水平在冬虫夏草中下调，微管蛋白相关基因MSTRG.3823，MSTRG.6894的表达水平均在子实体中上调，表明肌动蛋白和微管蛋白相关基因表达的改变可能在子实体发育中起作用。这些结果均与冬虫夏草的生长发育相关。2.

通过2-DE对冬虫夏草发育过程中的三个阶段（菌虫复合体、子座、整体体）及小金蝠蛾幼虫的蛋白质组进行分析，发现在冬虫夏草的生长过程中，小金蝠蛾幼虫与人