温度对胶原结构的影响(二维红外)

3.4.4温度对胶原结构的影响胶原蛋白作为细胞外间质对基体的热平衡发挥着重要的作用，基于热效应的各种理疗也都将通过胶原蛋白对细胞产生作用，另外，胶原蛋白作为一种天然高分子生物材料，温度对其变性过程也具有重大影响。所以，本节旨在通过二维红外相关光谱研究温度对胶原蛋白结构的影响。图3.7为胶原从25°C〜95°C间隔10C升温过程中的红外吸收光谱。随着温度的升高，胶原酰胺I带发生了蓝移，酰胺II带吸收峰却发生了红移，并且可以看出，酰胺I带的变化大于酰胺I带的变化。图3.7中还可以明显看出，3327cm-1处N—H伸缩振动吸收峰由钝逐渐变尖，这就说明，温度的升高，破坏了胶原内部氢键的结合，增加了胶原的无序结构。(•n<uolq」(•n<uolq」osq<3500 3000 2500 2000 1500 1000 500Wavenumbercm'图3.7 4000〜400cm-i范围内胶原从25°C〜95°C升温过程中的红外吸收光谱Fig.3.7Variabletempaerature(25C~95C)FTIRspectraofCollageninthespectrarangeof4000〜400cm-i二阶导数图谱能有效分辨出红外吸收峰中的重叠峰，能为二维红外相关分析提供大量信息。图3.8为胶原从25C~95C升温过程中在400~4000cm-1范围内的二阶导数图谱，从上到下依次为25C、35C、45C、55C、65C、75C、85C以及95C时的胶原红外动态吸收光谱。胶原蛋白在25C~95C升温过程中实际上是一个逐渐解螺旋的过程，胶原随着温度的升高，胶原分子间以及分子内的氢键被逐渐削弱，三股螺旋结构和肽链转角结构逐渐减少，而其伸展肽链及无序结构

却增多。1694cm-1、1524cm-1、1241cm-1为胶原胶原蛋白酰胺带的吸收峰，它们代表的是胶原分子间及分子内氢键结构，如图3.8所示，随着温度的升高，1694cm-1、1524cm-1处吸收峰都逐渐减弱甚至消失，同时1241cm-1处吸收峰也发生了蓝移，这无疑说明了胶原在升温过程中，其氢键结构在逐渐减少。另外，随着温度的升高，在1704cm-i、1504cm-1处吸收峰逐渐增强，1451cm-i处吸收峰也发生了蓝移，由此可以推断，1704cm-1、1504cm-1吸收峰代表的是胶原的肽链伸展或者胶原的无序结构。1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000Wavenumber/cm图3.8胶原在1750-1000cm-1波数范围内从25°C〜95°C升温过程中的二阶导数图谱Fig.3.8Secondderivativespectraintherangeof1750-1000cm-1forcollagen对胶原蛋白结构变化的研究主要集中在其酰胺带以及指纹变化区，图3.9为胶原从25°C〜95°C升温过程中1750~1000cm-1范围内的二维相关分析图。其中图3.9(a)为同步相关图，图3.9(b)为异步相关图。同步图中的自相关峰表示胶原结构随温度的敏感程度，同步交叉峰代表了胶原的基团振动吸收峰随温度升高其结构变化取向一致的行为；而异步交叉峰则代表了胶原基团振动吸收峰随温度升高其结构变化相对独立的行为。所以，若同步相关图中出现交叉峰，表明其对应在ul,u2上的一对基团振动峰的强度变化在升温过程中是彼此相关的。若异步相关图中出现交叉峰，表明其对应在ul，u2上的一对基团振动峰的强度变化在升温过程中是彼此独立，以不同速率变化的。©OOOCZDWOOO=c0@00cgsZX)1600-oLUQ」(l)quJnu(l)/\e/\A170013001400150016001700110012001700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 ©OOOCZDWOOO=c0@00cgsZX)1600-oLUQ」(l)quJnu(l)/\e/\A170013001400150016001700110012001700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000Wavenumber/cm'(b)厂luo/」a)quJnu(D>e/\/\1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000Wavenumber/cm'1(a)图3.9胶原在1750〜1000cm-1范围内从25°C〜95°C升温过程中的同步相关图(a)和异步相关图(b)Fig.3.9Synchronous(a)andasynchronous(b)spectraofcollagenduringvaryingtemperature

from25C〜95Cintherangeof1750〜1000cm-1根据二维红外判定规则对图3.9进行分析。如图3.9(a)所示，在对角线上的1704cm-1、1504cm-1、1446cm-1以及1238cm-1处出线了自动峰，特别是在1704cm-1、1504cm-1处，说明了这些吸收峰所对应的基团对温度升高比较敏感，特别是1704cm-1、1504cm-1处吸收峰对温度最为敏感；在0(1704,1504)、0(1704,1446)、0(1704,1238)、0(1504,1446)、0(1504,1238)、0(1446,1238)处出现了正交叉峰说明1704cm-1、1504cm-1、1446cm-1以及1238cm-1处吸收峰所对应的基团变化具有同步响应，在整个升温过程中的变化是正相关的。在图3.9(b)中，^(1704,1694)、^(1704,1572)、^(1704,1241)、^(1704,1033)、^(1704,1082)以及P(1504,1694)、P(1504,1572)、P(1504,1241)、P(1504,1033)、P(1504,1082)形成了负交叉峰，表明1704cm-1、1504cm-1处吸收峰所对应的官能团变化随着温度的升高与胶原原有特征官能团的变化相对独立，表现出不一致性。此外，1446cm-1、1238cm-1也与胶原原有特征吸收峰形成了异步相关峰，也表现出与胶原原结构特征吸收峰相对独立性。利用二维红外相关光谱判定规则，结合同步、异步相关图判定出胶原在升温过程中各个官能团变化的先后顺序。表3.9列出了胶原在从25C〜95C整个升温过程中各个官能团变化先后顺序。从表中可以看出，随着温度从25C逐渐升高，最先变化的是代表胶原C—H振动的1446cm-1处吸收峰，接下来变化的是胶原的酰胺I带、酰胺II带以及CH2基团振动吸收，然后才是1504cm-1、1704cm-1处吸收峰，最后才是胶原的酰胺III带。在整个温度升高的过程中，代表胶原原有结构特征的酰胺I带、酰胺II带首先随温度扰动而变化，接下来才是代表胶原无序结构及伸展肽链结构的1504cm-i、1704cm-1处吸收峰变化。这表明，胶原在升温过程中，三股螺旋间的氢键作用逐渐减弱，主要表现在其酰胺带吸收峰的变化，直至温度升到其变性温度后，胶原三股螺旋开始解链，氢键结构以及转角结构等减少，伸展肽链及无序结构反而增加，主要表现在1504cm-1、1704cm-1及1446cm-i处强度的显著变化。所有官能团吸收变化先后顺序如下：1461cm-i>1694cm-1>1524cm-1>1446cm-1>1504cm-1>1704cm-1>1572cm-1>1241cm-1。即胶原分子链中个基团的变化先后顺序为：一CH—>酰胺I带〉酰胺II带〉一CH2—>酰胺III带。表3.8胶原从25°C〜95°C升温过程中同步、异步二维相关强度以及强度变化顺序Table3.8Synchronous,asynchronous2Dcorrelationintensitiesandtheorderofintensity 95C①审变化顺序*0(1694,1461)>00(1694,1461)<01694后于1461cm-10(1524,1694)>00(1524,1694)<01524后于1694cm-10(1524,1446)>00(1524,1446)>01524先于1446cm-10(1446,1241)<00(1446,1241)<01446先于1241cm-10(1446,1504)>00(1446,1504)>01446先于1504cm-10(1704,1504)>00(1704,1504)<01704后于1504cm-10(1704,1572)<00(1704,1572)<01704先于1572cm-10(1241,1572)<00(1241,1572)>01241后于1572cm-1