厌氧菌属-厌氧菌（微生物检验技术课件）

第十一章厌氧菌鉴定学习目标１熟悉厌氧菌的分类及培养特点２熟悉梭状芽胞厌氧菌的生物学特性３掌握厌氧菌的微生物检验程序案例引入

患者赵某，女，63岁，患糖尿病10年。半个月前因足部不慎被玻璃划伤到社区医院就诊，医生给予口服抗生素治疗（具体用药不详）。两周后患者伤口仍不愈合，并出现发黑、肿胀、发臭，有黑色脓血渗出，遂到某三级医院治疗。医院以“疑为厌氧菌感染”收治入院，随后实习医生采集伤口附近坏死组织，送检验科微生物室查厌氧菌。2天后检验科以“只检出皮肤癣真菌，未检出厌氧菌”为由发回临床重新采集标本。……

新标本收到后第2天，检验科报告“检出厌氧菌（疑为产气荚膜梭菌）”。随后患者经临床对症治疗后病情好转出院。厌氧性细菌(anaerobicbacteria)指一群在有氧条件下不能生长，必须在无氧条件下才能生长繁殖的细菌。定义

厌氧菌感染的条件

局部组织的氧化还原电势降低：如血管损伤、烧伤、动脉硬化等，可造成局部组织的缺血、缺氧等。皮肤黏膜屏障被破坏：如大面积外伤伴有需氧菌感染，为厌氧菌感染提供了条件。机体免疫功能下降：如接受免疫抑制剂、放疗或化疗的患者；糖尿病、慢性肝、肾疾病及老人、婴幼儿、早产儿等。菌群失调：长期或大量应用广谱抗菌药物无效的患者，均可诱发厌氧菌感染。厌氧菌感染的临床特征局部有气体产生为重要指征之一；发生在黏膜附近的感染；深部外伤如枪伤、人或动物咬伤后的继发感染；分泌物有恶臭或暗红血色或在紫外光下发出红色荧光，或脓汁中有硫磺颗粒即为放线菌感染；某些抗生素治疗无效的感染；革兰染色着色不均、形态奇特、呈明显多形性；或镜检见细菌而需氧培养为阴性者。厌氧菌的分类分为两类：一类为有芽胞厌氧菌，只有一个属，即梭菌属，共有130个种，以芽胞形式存于体外。另一类为无芽胞厌氧菌，包括40多个属，300多个菌种和亚种；多为体内正常菌群，存在于皮肤、口腔、上呼吸道、肠道和泌尿生殖道。易引起这些部位的内源性感染。厌氧菌（40属、400种)梭状芽胞厌氧菌(10％)无芽胞厌氧菌（90％）

产气荚膜梭菌破伤风梭菌肉毒梭菌球菌杆菌G＋

G－球菌杆菌厌氧菌的分类标本采集与运送是否适当，对厌氧菌培养能否成功至关重要，须注意两点：厌氧菌标本的采集与送检1．标本绝对不能被正常菌群污染2．应尽量避免接触空气。1.标本的采集方法：2．标本的运送与处理：（1）针筒运送法：排尽空气，针头插入无菌橡皮塞中（2）无氧无菌小瓶运送法：0.0003%刃天青氧化还原指示剂，有氧时粉红色，无氧时无色（3）棉拭子运送法：一般不用。（4）大量液体标本运送法：液体装满标本瓶（5）组织块运送法：（6）厌氧袋运送法密闭厌氧罐，以金属铜吸收氧。标本送到实验室后，应在20~30min内处理完毕，最迟不超过2h，以免其中兼性厌氧菌过度生长而抑制厌氧菌生长。如一时来不及接种，可将标本置室温下保存，一般认为标本不要冷藏，因冷藏对某些厌氧菌有害，而且在低温时标本对O2吸收较多。每次标本接种前均应观察标本的性状并作详细记录，包括是否脓性、带血或腐败物质等和标本的气味，厌氧菌的代谢产物中有某种带气味的物质，对厌氧菌的鉴定很重要。常用厌氧菌的培养方法庖肉培养基法焦性没食子酸法厌氧罐法：常用抽气换气法和冷触媒法厌氧气袋法厌氧手套箱法焦性没食子酸——除氧剂庖肉基牛肉渣加适量肉汤，表面覆盖无菌的凡士林制备而成。肉渣中含有谷胱甘肽和不饱和脂肪酸，能吸收培养基中的氧气。厌氧袋冷触媒法：利用气体发生器产生氢气，后者在触媒的作用下与罐内的氧气结合成水，从而造成无氧环境。以亚甲蓝指示液检查无氧状态：有氧时显蓝色，无氧时被还原为无色第一节

梭状芽胞杆菌属梭状芽胞杆菌属梭状芽胞杆菌属（Clostridium）简称梭菌属，是厌氧芽胞杆菌（anaerobicsporeformingbacilli）的唯一菌属，有130个种。革兰染色阳性，芽胞呈圆形或卵圆形，直径大于菌体，位于菌体中央，极端或次极端，使菌体膨大呈梭状。本菌属细菌在自然界分布广泛，临床有致病性的主要有破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌与艰难梭菌等。1.破伤风芽胞梭菌（C.tetani）破伤风梭菌是梭菌属中常见的一种芽胞杆菌，能引起破伤风。菌体细长，约为2.0～5.0×0.5～1.5μm。有周鞭毛，能运动，无荚膜。芽胞正圆形大于菌体，位于菌体顶端呈鼓槌状。（鉴定要点之一）鞭毛破伤风杆菌镜下形态（18-24h）革兰染色破伤风杆菌镜下形态（48h）革兰染色培养特性专性厌氧，在梭菌培养基上37℃培养48h，菌落直径2～4mm，扁平、灰白色、边缘疏松呈羽毛状，伴β溶血。在庖肉培养基中，肉渣部分消化，微变黑，有少量气体。生成甲基硫醇及H2S，导致培养物有腐败性恶臭。破伤风杆菌在厌氧平板上羽毛状菌落左侧：在疱肉培养基上生长右侧：阴性对照生化反应大多生化反应阴性，一般不发酵糖类液化明胶，H2S＋，靛基质＋，硝－，对蛋白质有微弱的消化作用。抵抗力芽胞抵抗力强，在干燥的土壤和尘埃中数十年不死，能耐干热150℃1h，煮沸100℃1h方可杀灭。对1%碘敏感，对青霉素、磺胺药敏感。微生物学检查法一般不进行涂片镜检和分离培养典型的症状和病史即可作出诊断致病条件与毒素伤口需形成厌氧微环境伤口窄而深（如刺伤），有泥土或异物污染大面积创伤、烧伤，坏死组织多，局部组织缺血有需氧菌或兼性厌氧菌混合感染的伤口无侵袭力，仅在局部繁殖，外毒素致病对氧敏感的破伤风溶血毒素(tetanolysin)质粒编码的破伤风痉挛毒素(tetanospasmin)属神经毒(neurotoxin)，毒性极强(对人致死量<1µg)蛋白质，不耐热1.破伤风痉挛毒素（tetanospasmin）：毒素作用于脊髓前角运动细胞，封闭了抑制性神经纤维释放抑制性神经介质，导致肌肉的强直性收缩。破伤风溶血素（tetanolysin）：作用机制目前尚不明确。作用机制与免疫性作用机制见图破伤风免疫属外毒素免疫，主要是抗毒素发挥中和作用抗毒素人工免疫典型症状苦笑面容角弓反张其他防治原则防止创口厌氧微环境的形成特异性预防：注射破伤风类毒素紧急预防：注射破伤风抗毒素（tetanusantitoxin，TAT）特异性治疗：早期足量抗毒素及抗生素2.产气荚膜梭菌(C.perfringens)

两端平切粗大杆菌芽胞位于次极端，呈椭圆形，不大于菌体无鞭毛体内有明显的荚膜大小：为(1－2)μm×(2－10)μm。芽胞：位于菌体中央或近端，卵圆形，直径不大于菌体的直径。荚膜：在人和动物活体组织内，或在含血清的培养基内生长时可形成荚膜。生物学特性（1）血琼脂培养生长菌落周围出现双层溶血环，内层β溶血，外层α溶血，好似靶状。菌落呈灰褐色，与空气接触30min后，可逐渐变为灰绿色，这是本菌的特征之一。培养特性

菌落周围出现乳白色浑浊圈，是由细菌产生的卵磷脂酶（α毒素）分解蛋黄中卵磷脂所致；若在培养基中加入α毒素的抗血清，α毒素可被中和。（2）卵黄琼脂培养生长培养特性

能分解乳糖产酸使酪蛋白凝固，并产生大量气体冲击凝固的酪蛋白呈蜂窝状，气势凶猛，这个现象称为“汹涌发酵”。本菌鉴别的主要特征。（3）牛乳培养基生长培养特性

细菌生长迅速，肉渣不被消化，但呈粉红色，肉汤浑浊，并产生大量气体。用于封闭的凡士林被顶起气体产生（4）疱肉培养基生长培养特性

若在卵黄平板上，加入抗α毒素的抗血清，则不出现混浊，此现象称为Nagler反应，可用于该菌的鉴定。（1）血清学试验右边为对照左边加抗血清生化试验*发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，产酸产气；*H2S试验阳性，能将亚硫酸盐还原为硫化物，在含亚硫酸盐及铁盐的琼脂中形成黑色菌落。（2）其他生化试验生化试验2．传播途径：创伤感染、消化道。3．所致疾病：气性坏疽、食物中毒、坏死性肠炎。1．致病物质：荚膜、多种外毒素、侵袭性酶，有12种之多。临床意义致病物质：外毒素、酶、荚膜等α毒素卵磷脂酶破坏细胞膜，溶解红细胞。κ毒素胶原酶能分肌肉及皮下胶原纤维，使组织崩解。μ毒素透明质酸酶分解细胞间质中的透明质酸。γ毒素DNA酶分解DNA，降低坏死组织的粘稠度。肠毒素导致食物中毒。所致疾病气性坏疽食物中毒坏死性肠炎及时清创扩创注射青霉素高压氧舱治疗防治原则微生物学检查法（一）直接涂片镜检深部创口取材涂片革兰阳性大杆菌白细胞少且不典型伴有其他杂菌早期诊断可避免患者最终截肢或死亡分离培养及动物实验接种血平板或庖肉培养基，镜检及生化反应鉴定动物实验如怀疑食物中毒，在发病后一日内，检出大于105病菌/克食品或106病菌/克粪便可确立诊断。微生物学检查法（二）防治原则预防及时处理伤口，破坏和消除厌氧微环境预防性的使用抗生素治疗局部感染的处理抗生素α抗毒素高压氧舱法3.肉毒梭菌（C.botulinum）

芽胞椭圆形，粗于菌体，位于次极端，呈汤匙状或网球拍状；神经毒素分A～G7个型，各型毒素只能被同型抗毒素中和；肉毒毒素不耐热，煮沸1分钟即可被破坏。培养特性：严格厌氧，营养要求不高。在卵黄琼脂平板上，菌落周围出现浑浊圈。（G型除外）在血皿上形成不规则、灰白色半透明菌落，有β-溶血现象。（产生脂酶）接种的平板应快速放入厌氧环境中。

细菌生长迅速，肉渣能被消化，变黑，有腐败恶臭味道。常用疱肉培养基增菌培养特性肉毒芽胞梭菌在庖肉培养基上的生长现象（右侧为对照）乳糖－、葡萄糖+、麦芽糖+、I－、H2S+G型除明胶液化试验+外，其余均为－。生化反应致病性致病物质肉毒毒素剧毒（对人致死量为0.1µg)目前已知毒力最强的生物毒素作用机制作用于外周神经肌肉接头处，抑制外周神经介质乙酰胆碱的释放，导致肌肉弛缓性麻痹。前体分子存在，可稳定存在于外环境和胃肠道。复合物进入小肠后，在碱性情况下解离，被吸收进入血循环。所致疾病食物中毒进食污染食物（多为罐头、肉制品、豆制品）发生食物中毒---食入毒素临床表现：少见胃肠道症状，主要为神经末梢麻痹（松弛型）婴儿肉毒病以6个月以内的小婴儿居多症状与肉毒食物中毒类似，便闭、吸乳、啼哭无力微生物学检查法标本食物中毒患者：食物婴儿肉毒病患者：粪便粪便、食物等标本可先80℃加热10分钟，再厌氧培养（疱肉培养基增菌，再接血平板和卵黄琼脂平板进行次代培养）毒素检查防治原则加强食品卫生管理和监督，提高防范意识（低温保存食物，高温破坏毒素）。尽早根据症状作出诊断，迅速注射A、B、E三型多价抗毒素，同时加强护理和对症治疗。4.艰难梭菌（C.difficile）

该菌是人和动物肠道寄生菌，在幼儿的粪便中最常见，为肠道正常菌群成员。长期或大量使用抗菌药物后，使得艰难梭菌被药物选择出后大量繁殖而导致抗生素相关性腹泻。

生物学性状革兰阳性粗长杆菌，大小约1.3～1.6μm×3.6～6.4μm，有的菌株有周鞭毛，芽胞为卵圆形，位于菌体次极端，无荚膜。严格厌氧，在血琼脂平板上，48h培养后，菌落直径3～5mm，圆形，略凸起，白色或淡黄色、不透明、边缘不整齐、表面粗糙。在CCFA平板上生长的菌落在紫外线照射下可见黄绿色荧光。艰难梭菌在血平板上菌落特征48h艰难梭菌在CCFA平板上菌落特征48h致病性产生A、B两种毒素A毒素为肠毒素，能使肠壁出血坏死，液体积蓄B毒素为细胞毒素，能直接损伤肠壁细胞，造成伪膜性结肠炎。实践十

厌氧菌的鉴定（一）细菌在选择性培养基和肉汤中的生长现象菌种庖肉培养基牛乳培养基血皿卵黄琼脂平板破伤风梭菌产气荚膜梭菌结果与讨论（二）革兰染色镜检结果菌种形态排列染色性破伤风梭菌产气荚膜梭菌结果与讨论2023/7/2863无芽胞厌氧菌1.无芽胞厌氧杆菌

G-杆菌：类杆菌属和梭杆菌属（第二节）

1-1.脆弱类杆菌：寄生消化道腹部和会阴部感染、脑脓肿、败血症等

1-2.产黑色素类杆菌：寄生口腔、下消化道及泌尿生殖道、口腔、牙龈感染，泌尿生殖道感染等

1-3.梭杆菌属：寄生口腔和上呼吸道致牙周炎

G+杆菌：丙酸杆菌属、真杆菌属、乳酸杆菌属和双歧杆菌属（第三节）

2.厌氧性球菌（第四节）

G-球菌：以韦荣菌属最重要，咽喉部主要厌氧菌。

G+球菌：消化链球菌属，主要寄居阴道。第二节

革兰阴性无芽胞厌氧杆菌革兰阴性无芽胞厌氧杆菌（G-杆菌）这是一群不形成芽胞的厌氧杆菌，是人体正常菌群的重要组成成员，部分菌株可作为条件致病菌引起感染。常见菌属有：类杆菌属普雷沃菌属紫单胞菌属梭杆菌属一、类杆菌属类杆菌属(Bacteroides)是临床上最重要的革兰阴性无芽胞厌氧杆菌，临床标本中以脆弱类杆菌（B.fragilis）最常见。脆弱类杆菌为革兰阴性，大小为(0.8～1.3μm)×(1.6～8μm)，着色不均，两端钝圆而浓染，中间不着色染色较浅似空泡。在陈旧培养物或含糖的液体培养基中呈明显多形性，无鞭毛、无芽胞，多数有荚膜。脆弱类杆菌占临床厌氧菌分离株的25%，占类杆菌分离株的50%，居临床厌氧菌分离株的首位。脆弱类杆菌在一定条件下可引起人体内源性感染，如脑脓肿、腹膜炎、阑尾炎、女性生殖系统及盆腔感染。脆弱拟杆菌的两极浓染及菌体的多形性一、类杆菌属二、产黑色素普雷沃菌普雷沃菌属(Prevotella)是从类杆菌属分出的一个新菌属，代表菌种是产黑色素普雷沃菌。革兰阴性球杆状，大小约0.8～1.5µm×1.0～3.5µm，排列成双或短链，两端钝圆，有浓染和空泡。二、产黑色素普雷沃菌专性厌氧菌，在厌氧平板上2～3天培养后，菌落直径为0.5～3mm，圆形、凸起、不透明，许多菌株呈β-溶血。菌落在紫外光（波长366nm）照射下有砖红色荧光，逐渐转为褐黑色和棕色菌落，5～7天转为黑色菌落，色素出现后荧光即消失。临床上较常见的条件致病菌，可引起内源性感染，常与其他厌氧菌、需氧菌或兼性厌氧菌引起混合感染。临床上是引起口腔与牙周感染、肺部感染及女性生殖系统感染常见菌之一。三、不解糖紫单胞菌紫单胞菌属(Porphyromonas)又称卟啉单胞菌属。代表菌种是不解糖紫单胞菌。革兰阴性杆菌或球杆菌，大小约1.5～3.5µm×0.8～1.5µm，两端钝圆，着色不均匀。35～37℃厌氧培养3～5d可形成1～2mm圆形、凸起、表面光滑、边缘整齐、棕色或黑色菌落。维生素K1和氯化血红素可促进本菌生长及黑色素的产生。

不解糖紫单胞菌主要分布于人类口腔、泌尿生殖道和肠道，在正常人体的检出率较低。主要引起人类牙周炎、牙髓炎、根尖周炎，也可引起胸膜炎、阑尾炎和细菌性阴道炎，尚可引起头、颈部和下呼吸道感染。三、不解糖紫单胞菌四、具核梭杆菌梭杆菌属（Fusobacterium）是临床常见的革兰阴性无芽胞厌氧杆菌，形态细长，两端尖细如梭。坏死梭杆菌形态致病性坏死梭杆菌是毒力很强的梭杆菌，常引起急性扁桃体炎，有时并发单核细胞增多症，是儿童和青年人扁桃体周围脓肿中最常分离到的厌氧菌。局部症状还包括颈间隙感染和颈静脉脓毒性血栓静脉炎，尚可引起胸膜渗出性脓胸、增生性转移脓肿和菌血症。第三节

革兰阳性无芽胞厌氧杆菌革兰阳性无芽胞厌氧杆菌（G+杆菌）革兰阳性无芽胞厌氧杆菌(anaerobicnonsporeformingGram-positivebacilli)有6个属，几十个菌种，临床常见的有丙酸杆菌、优杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、蛛网菌和放线菌。它们多是人和动物皮肤、口腔、肠道等部位的重要生理菌群，在体内起到调节和维持人体微生态平衡的重要作用。它们的菌落、生化反应、菌体形态等都很相似，鉴定较难。应用气液相色谱法（GLC），根据其代谢产物不同，可对菌属做出初步判定。菌属主要特征（G＋C）%丙酸杆菌属主要代谢产物丙酸53～67乳杆菌属唯一的代谢产物乳酸32～53双岐杆菌属代谢产物乙酸＞乳酸55～67真杆菌属主要代谢产物乙酸、丁酸、甲酸30～40放线菌属代谢产物琥珀酸、乳酸、少量乙酸和甲酸57～69确定为厌氧菌后，在排除芽胞存在的前提下，进行属间推断性鉴别。微生物学检验第四节

厌氧球菌厌氧球菌厌氧性球菌(Anaerobiccocci)是临床厌氧感染的重要病原菌，约占临床厌氧菌分离株的25％。革兰阳性:消化球菌属消化链球菌属革兰阴性:韦荣球菌属一、消化球菌属黑色消化球菌(Peptococcusniger)是消化球菌属中唯一的菌种。革兰阳性球菌。直径0.3～1.3μm，单个、成双、短链或成堆排列。无芽胞，无荚膜。专性厌氧菌，生长缓慢，厌氧培养2～4天形成黑色不溶血的小菌落。标本黑色有臭味是该细菌感染的重要特点。

二、消化链球菌属代表菌为厌氧消化链球菌。革兰阳性球形或卵圆形，大小不等，菌体直径0.3～1μm，常成双或呈短链状排列。无鞭毛，无芽胞，无荚膜。二、消化链球菌属专性厌氧，营养要求较高，需羊血和血清培养基才能生长。在厌氧血平板上，菌落直径0.5～1mm，灰白色、凸起、不透明、边缘整齐，一般不溶血，偶有甲型或乙型溶血。生化反应不活泼，在硫乙醇酸钠液体培养基中，呈颗粒状沉淀生长。在其平板上生化反应较为明显，吐温-80可促进其生长。临床厌氧菌分离株中占比例较高，仅次于脆弱类杆菌，居第2位。三、韦荣球菌属

韦荣球菌属细菌形态相似，为革兰阴性球菌。直径0.3～0.5μm，多排列成对、近似奈瑟球菌。无鞭毛、无芽胞。专性厌氧，血琼脂平板上生长良好，培养48h后，形成直径1～2mm圆形、凸起、灰白色或黄色混浊、不溶血菌落；在硫乙醇酸盐肉汤中混浊生长，产生小气泡。新鲜培养物立即置紫外线下照射，菌落可显红色荧光，接触空气后荧光消失。生化反应不活泼，不分解糖类，还原硝酸盐。韦荣球菌是口腔、咽部、胃肠道和女性生殖道的正常菌群，为条件致病菌，引起人体内源性感染，感染多为混合感染。厌氧菌的检验总结归纳标本的采集与运送是否适当，对厌氧菌培养能否成功至关重要。临床在进行厌氧菌培养前应与实验室联系，以便实验室做好接种培养的准备。须注意两点：①标本不能被正常菌群所污染；②应尽量避免接触空气。某些标本不适合做厌氧菌培养：如鼻咽拭子、痰液、流出的脓液、阴道分泌物、粪便等。标本的检查方法实验室收到标本应在20～30min内处理完毕，最迟不超过2h。如不能及时接种，应将标本保存于室温（冷藏对厌氧菌有害）。直接检查：实验室收到标本应仔细观察其性状，包括气味、是否脓性、带血或黑色坏死组织、硫磺样颗粒及紫外灯下有无荧光等。除血液外，各种标本均须直接涂片作革兰染色镜检，发现染色不均，形态奇特者常为厌氧菌的表现。标本的分离培养初代培养：厌氧菌的初代培养比较困难，不仅要创造无氧环境，还要选择适当的培养基。在培养基选择上应注意：

1.尽量使用新鲜培养基，2～4ｈ内用完；

2.使用前放入无氧环境，预还原处理24～48ｈ；

3.也可采用预还原灭菌法制备的培养基；

4.液体培养基应煮沸10min，驱除溶解氧，并迅速冷却，立即接种。培养基的选择根据镜检结果选择合适的培养基，常用的有非选择性和选择性培养基两种。非选择培养基：以牛心脑浸液及布氏