分子育种学课件分子标记与植物育种

分子育种学

——分子标记与植物育种遗传标记？

类型与特点？

建立？

应用？分子育种学

——分子标记与植物育种遗传标记？

类型与特点？

本章主要内容（一）、遗传标记概述（二）、分子标记的类型及其基本原理（三）、分子标记辅助选择（四）、分子标记在植物遗传育种中的应用（五）、存在问题本章主要内容（一）、遗传标记概述1、概念遗传标记是指受基因控制的能够稳定遗传的，且能代表个体或群体的遗传特性，并可被用作遗传分析的某种特征。理想的遗传标记应具备的条件：多态性高、遗传稳定、遗传行为简单、能检测整个基因组、不受环境影响、操作经济、简单等（一）、遗传标记概述1、概念（一）、遗传标记概述2、遗传标记的类型根据建立标记的对象可分为：形态学标记MorphologicalMarker

细胞学标记CytologicalMarker

生化标记BiochemicalMarker

DNA分子标记DNAMolecularMarker

2、遗传标记的类型根据建立标记的对象可分为：*形态标记：是生物特定的肉眼可见或简单工具可测量的外部形态特征。影响这一特征的基因及其所在的染色体以及其相邻基因在图谱上的位置都已明确。孟德尔首先将形态标记作为遗传标记-分离规律和独立分配规律；长期以来植物种质资源鉴定及育种材料选择一般都是根据形态标记进行的。（1）形态标记*形态标记：是生物特定的肉眼可见或简单工具可测量的外部形态分子育种学课件分子标记与植物育种标记性状标记基因（括号内数字表示所在连锁群）色素

花色W1，w1（8）茸毛色T，t（1）荚色L1，l1（5）；L2，l2种皮G，g（3）种脐R，r-m（2）；I，i-i，I-k，i（7）双色K1；K2；K3子叶色D1（3）；D2；Cyt-G，Y3叶

小叶数目L-f1，l-f2叶形ln（4）；Lo，lo；l-w1，l-w2；l-b1,l-b2；落叶性A叶绿素缺失V1；y3；y4；…y20茸毛类型Pa1，pa1；Pa2，pa2；P1，p1（2）；P2，p2（4）；Pb，pb（14）；Pc，pc；Pd1，pd2；Ps，ps茎

扁化茎f(11)节间长度S，s短叶柄Lps，lps矮杆df2（6）；df3；df4；df5（1）大豆部分形态标记性状及标记基因

标记性状标记基因（括号内数字表示所在连锁群）色素

花色W1，形态标记技术的评价优点：简单直观缺点：数量少、多态性差易受环境条件因素影响显隐关系要通过自交或杂交来检出形态标记技术的评价细胞学标记：以染色体结构和数目为基础的标记。能够与特定的表型结合起来，从而确定控制某些性状的基因所在的染色体或染色体区段连锁遗传和染色体学说（2）细胞学标记细胞学标记：以染色体结构和数目为基础的标记。能够与特定的表型染色体三体名称特征1三体1（草状）生长缓慢，高度不育，籽粒较细长且稍呈三角形，叶窄，与草相似2三体2（矮生）小穗短，护颖较长，自交高度不育，叶片短且基部附近常扭曲3三体4（不育）植株最矮，叶片短厚呈革质，中脉凸出，穗伸出不完全，自交完全不育4三体12（高秆）植株最高，叶片下垂，叶舌长，育性正常5三体5（叶片扭曲）叶片短且扭曲，有密生茸毛，穗短，小穗着生紧密，结实率高6三体3（有芒）籽粒有芒，叶片厚而半卷，叶舌长，自交高度不育7三体7（窄叶）叶片窄而半卷，穗稍疏松，不完全伸出，部分可育8三体8（卷叶）叶片窄卷，叶舌短，籽粒短而粗，部分可育9三体9（粗壮）叶片厚而浓绿，茎秆短，小穗最大，百粒重最高10三体10（短粒）叶舌有毛，叶片直立，育性正常11三体11（拟正常）与二倍体姊妹系无法区别，育性正常，需细胞学鉴定12三体6（丛生）外型呈丛生草状，穗部顶端小穗退化，育性高水稻IR36初级三体的形态特征(Khushetal.1984)染色体三体名称特征1三体1（草状）生长缓慢，高度不育，籽粒较细胞学标记的核心技术是显微镜技术核型分析—把体细胞内染色体显微摄影后再放大照片，按照染色体相对长度、臂指数、着丝粒指数、染色体臂数等将染色体作系统排列，显示染色体的特征染色体分带技术—将所有染色体制片用不同手段处理，再用不同染料染色，染色体显示出不同的带数，如G带、C带、N带等，明确鉴定许多物种中任一染色体细胞学标记的核心技术是显微镜技术分子育种学课件分子标记与植物育种普通小麦的N带与C带普通小麦的N带与C带玉米染色体荧光核型（9个探针）小麦-中间偃麦草附加系黄A染色体；棕B染色体红D染色体；绿偃染色体玉米染色体荧光核型小麦-中间偃麦草附加系评价：克服了形态标记易受环境影响的缺点，但这种标记材料的产生需要花费大量的人力物力进行培养选择，从而限制了细胞学标记的应用。

有些物种对染色体结构和数目的变异的耐受性较差，难以获得相应的标记材料某些物种虽然已有细胞学标记材料，但这些标记常常伴有对生物有害的表型效应，或有时观察和鉴定比较困难评价：生化标记：建立在生化遗传学基础上的特异性同功酶或蛋白质。其编码基因的位置及其与其它基因位点的连锁关系也是明确的。蛋白质是由基因编码的，特定的基因型决定了蛋白质的特定组成，因此蛋白质组成能够反映出其特征或特性主要利用种子蛋白：数量丰富、稳定、易于提取（3）生化标记生化标记：建立在生化遗传学基础上的特异性同功酶或蛋白质。其编1941年BeadleWG等提出了“一个基因一个酶”的假说，创立了生化遗传学。50年代许多科学家发现同一种酶可具有多种不同的形式。同时由于淀粉凝胶电泳技术的发展和化学染色剂的使用，使这种酶的多种形式成为肉眼可辩的带型——酶谱。1959年，Markert等提出了用同工酶（isozyme）一词来描述具有同一底物专一性的不同分子形式的酶，并证实同工酶具有组织、发育及物种的特异性。20世纪60-70年代出现了在蛋白质水平反映生物遗传变异的同工酶标记。

生化标记的发展1941年BeadleWG等提出了“一个基因一个酶”的假同工酶基因染色体酸性磷酸酶Acp-112

Acp-212

Acp-37乙醇脱氢酶Adh-111氨基肽酶Amp-12

Amp-28

Amp-36

Amp-48β-淀粉酶β-Amy-17过氧化氢酶Cat-16内肽酶Enp-16酯酶Est-26

Est-39

Est-51

Est-77水稻的部分同工酶标记

同工酶基因染色体酸性磷酸酶Acp-112

Acp-212

A以基因表达的结果为基础，是对基因的间接反映共显性，数量上更丰富，受环境影响更小，能更好地反映遗传多态性，因此生化标记是一种较好的遗传标记，已被广泛应用于物种起源和进化研究、种质鉴定、分类和抗病性筛选等领域。但仍然存在诸多不足，如每一种同工酶标记都需特殊的显色方法和技术；某些酶的活性具有发育和组织特异性；局限于反映基因组编码区的表达信息等。最关键的不足是其标记数量还比较有限不能成为理想的遗传标记生化标记的评价

以基因表达的结果为基础，是对基因的间接反映生化标记的评价DNA分子标记：根据遗传物质DNA本身的变异而建立的标记。确定DNA多态性与特定性状或DNA片段的关系。1980年Botstein等首次提出了DNA限制片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)的概念，并指出RFLP可作为遗传标记，从此开创了利用DNA多态性进行分子标记的新阶段。1985年Mullis发明了PCR(DNA聚合酶链式反应)技术，推动产生了许多以PCR为基础新型的分子标记随着DNA研究技术的不断发展，分子标记的类型越来越丰富，已广泛用于很多研究领域。（4）DNA分子标记DNA分子标记：根据遗传物质DNA本身的变异而建立的标记。确DNA分子标记的特点①直接对DNA进行标记，在植物体的各种组织、器官，不同发育时期均可检测到，不受环境、季节的限制，不存在表达与否的问题②类型丰富，数量多，遍及整个基因组③多态性高，自然存在着许多等位变异，不需要创造特殊的材料④许多类型的分子标记表现位共显性，能够鉴别出纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息⑤表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁关系⑥可对控制任何目标性状的基因进行标记理想的遗传标记DNA分子标记的特点理想的遗传标记DNA分子标记的多态性DNA分子标记的多态性共显性标记（Co-dominantmarker）杂合体显示双亲的带型显性标记（Dominantmarker）杂合体显示双亲之一的带型FMFFHHHHHFMMMMMFMF/HDNA分子标记的显性与共显性共显性标记显性标记FMFFHHHHHFM（二）、分子标记类型及其基本原理1、分子标记的类型按核心技术分以分子杂交为基础的的标记以PCR为基础的标记其它类型的分子标记（PCR和分子杂交结合、测序）按建立标记的DNA序列来源分以基因组DNA为基础的标记以EST为基础的标记（二）、分子标记类型及其基本原理1、分子标记的类型2、常用分子标记技术简介

1）限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）原理：生物体在长期的自然选择和进化过程中，由于个别碱基的突变以及序列的缺失、插入或重排，会造成DNA在核苷酸序列上出现差异，从而导致限制性内切酶识别位点的不同，当用限制性内切酶来消化不同材料的DNA时，会产生数目和大小不同的DNA片段，电泳后经转膜和与探针杂交，就可以得到DNA限制性片段长度多态性。1980年Botstein等首次提出2、常用分子标记技术简介1）限制性片段长度多态性（RestRFLP技术流程RFLP技术流程探针探针RFLP产生的原因——多态性基础A）点突变RFLP产生的原因——多态性基础A）点突变RFLP产生的原因——多态性基础B）缺失RFLP产生的原因——多态性基础B）缺失RFLP产生的原因——多态性基础C）插入RFLP产生的原因——多态性基础C）插入RFLP图例RFLP图例RFLP标记的优点①具有共显性特点，可以区别基因型纯合与杂合，能提供单个位点上较完整的资料；②标记无表型效应，不受环境和发育条件影响；③在非等位RFLP标记之间不存在上位效应，因而互不干扰；④标记源于基因组DNA的自然变异，数量上几乎不受限制缺陷：RFLP标记对DNA需要量较大，操作繁琐，花费昂贵其应用受到一定程度的限制；（早期）主要用于遗传连锁图的绘制和目标基因的标记RFLP标记的优点2）DNA指纹（DNAFingerprinting，DF）实际上是RFLP的一种特殊类型。其基本原理与RFLP是一致的，不同的是所用的探针，RFLP所用的探针是单拷贝或低拷贝，而DF所用的探针是多拷贝或高拷贝的小卫星、微卫星或人工合成的简单重复序列。2）DNA指纹（DNAFingerprinting，DF3）随机扩增多态性DNA（RandomAmplifiedPolymorphismDNA，RAPD；RP-PCR；AP-PCR

）1990年Williams和Welsh原理：以一个人工合成的随随机的寡核苷酸序列(通常为10个碱基)作引物，以基因组总DNA为模板，利用PCR技术随机扩增基因组DNA的不同位点，再经凝胶电泳分开，得到一系列多态性DNA片段。3）随机扩增多态性DNA（RandomAmplifiedRAPD中多态性产生的基础片段数量、大小和有无

①核苷酸置换造成引物与结合位点无法匹配②某个引物结合位点缺失③两引物结合位点间的间距过大，因片段太长致使扩增中断（<3kb)④插入或缺失改变了扩增产物的大小RAPD中多态性产生的基础RAPD中多态性产生的基础RAPD中多态性产生的基础分子育种学课件分子标记与植物育种RAPD标记的优、缺点无需知道有关模板DNA的结构信息；引物没有种属特异性模板DNA用量少，纯度要求不高操作简便快速，可实现自动化操作RAPD标记是显性标记，不能区分纯合型和杂合型扩增产物易受反应条件影响，实验结果重复性较差。“匿名”及共迁移（同带-同片段？1带-1片段？）RAPD标记的优、缺点4）扩增片段长度多态性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP)

/variants/aflp.htmZabean等于1992年发明的一项专利技术原理：基因组DNA经2个限制性内切酶酶切后，与特定接头相连接，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，进行特异性PCR扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测扩增片段的多态性。由于不同材料的DNA片段存在差异，因而便产生了扩增产物的多态性。实际上它是RFLP与PCR结合的一种中间产物。4）扩增片段长度多态性(AmplifiedFragmentAFLP技术流程AFLP技术流程a）酶切和接头连接

双链接头由核心序列和酶切特异性序列组成，通过互补的碱基与酶切序列连接（阻止第2次酶切的发生）核心序列酶切特异性序列核心序列a）酶切和接头连接双链接头由核心序列和酶切特异性序列组b）预扩增

所用引物由对酶切序列特异性的核心序列和3’

端选择性单碱基组成，接头序列和酶切位点作为预扩增的结合位点b）预扩增所用引物由对酶切序列特异性的核心序列和3’端c）选择性扩增

选择扩增的引物是在预扩增引物的基础上增加2个碱基（16种组合），用同位素或其它方法标记c）选择性扩增选择扩增的引物是在预扩增引物的基础上增加2d）扩增产物的检测聚丙烯酰胺凝胶电泳检测放射性同位素标记引物荧光标记引物银染技术检测片段数酶切片段数d）扩增产物的检测聚丙烯酰胺凝胶电泳检测检测片段数酶切AFLP的优点AFLP结合了RFLP和RAPD的优点，稳定可靠，重复性好，灵敏度高，快速高效不需要分子杂交，不需要预先知道DNA的序列信息部分为共显性标记，显示的多态性信息量也很高。标记非常丰富，在多态性低、待测样品也较少的情况下用AFLP能达满意的结果AFLP标记的缺点是一种专利技术，受专利权保护对DNA纯度和内切酶的质量要求较高需标记引物或采用银染技术，昂贵费时，操作难度大AFLP的优点5）微卫星DNA真核基因组中存在着大量的串联重复序列,按重复单位的大小,串联重复可分为卫星（重复序列>70bp）、小卫星（6～70bp）和微卫星DNA(1-6bp)。微卫星(Microsatellite,MS)

是指基因组中以少数几个核苷酸(多数为2～4个)为单位多次串联重复组成的长达几十个核苷酸的序列，又称简单序列重复(SimpleSequenceRepeats,SSR)

或短串联重复(ShortTandemRepeats,STR)

、或简单序列长度多态性(SimpleSequenceLengthPolymorphism，SSLP)重复数目是可变的，重复序列两侧都有物种特异性的保守序列，所以通过设计引物进行PCR扩增，就可以检测到不同的DNA区域重复数目的多态性。5）微卫星DNASSR的多态性基础SSR(数目变异)旁邻或侧翼序列(具有保守性——引物设计)SSR的多态性基础SSR(数目变异)旁邻或侧翼序列(具有保SSR的类型根据重复结构1）完全重复型(perfect),单一序列单元无中断或无颠倒2）不完全重复型(imperfect),单一序列单元有中断或有颠倒；3）混合型(compound)，不同序列混合、中断根据来源的序列1）gSSR：来源于基因组序列2）EST-SSR：来源于EST（表达序列标签）SSR的类型aacgggtcattttgaggaggtgtgctgctggggagggggtagcggcagcgctagtgaaagagaagaagaagaaggaggaggaggaggaggaggaagaggaggaagggaggcagaaggagcagatgaaagaagagaatatgaatatggatgtggatgtggtcatggaagaaggggacgacgacaacaagaagaacgacgacgacgacgacgacgacgacgacgacgacgacgacggggatgtaacaagtccgccgccggcggctgaggatgagaccaaggatggtggaaaggctaa

agg-

不完全重复cga-完全重复--aggagatgagtctctctctctctctcgaagaagaagaagaagaatc混合型aacgggtcattttgaggaggtgtgctgctgSSR的分布在基因组中的分布更为随机，不仅可以存在于内含子中，也可以存在于编码区及染色体上的其它任一区域。不同物种基因组中的分布频率有所差异：大麦、番茄、水稻、马铃薯及拟南芥基因组DNA序列中分别为1/7.4、1/7.1、1/7.4、1/6.4和1/6.0kb(Cardle等，2000)；人类基因组1/6kb(Beckmann等1992)EST中也广泛存在着SSR：不同物种的EST-SSR分布频率存在很大差异，1/3.4kb-1/20kb；在单子叶和双子叶植物中EST-SSR数量和分布也有差异,平均分别为1/64.6kb和1/21.2kb不同EST位置的SSR含量与重复类型也各不相同:编码区主要是三核苷酸重复类型，3′端非翻译区主要是三、四核苷酸重复类型，5′端非翻译主要是二、三核苷酸重复类型SSR的分布几种植物中EST-SSR的分布频率和主导类型几种植物中EST-SSR的分布频率和主导类型SSR标记的开发

前提：知道重复序列两侧的DNA序列传统的SSR标记开发基因组DNA提取限制性酶切或超声波处理分离小片段DNA连接到载体转化大肠杆菌构建基因组文库合成SSR探针杂交筛选阳性克隆测序并设计引物SSR-PCR及多态性分析SSR标记的开发前提：知道重复序列两侧的DNA序列基因组传统的SSR分子标记开发方法简单、易掌握这种方法在许多作物的SSR标记开发中被广泛应用，现已获得的基因组SSR标记中，四分之三以上的是利用传统开发方法获得的但必须对每个克隆进行筛选鉴定，工作量大，需花费大量人力，财力，而且效率较低，植物中已报道的阳性克隆比率约为2%～3%，成功获得引物的机率则更低。传统的SSR分子标记开发方法简单、易掌握通过富集策略开发SSR标记为简化技术环节，提高效率，降低开发成本，通过研究建立了多种采取富积策略的SSR标记开发方法基于RAPD的开发策略将RAPD随机引物与SSR连接，作为PCR扩增引物或者将RAPD扩增产物条带用SSR探针进行Southern杂交，可以有效富集重复序列。虽然目前尚不清楚RAPD有利于SSR富集的机理,但这一发现大大激发了人们探求富集SSR方法的兴趣。通过富集策略开发SSR标记PIMA

(PCRIsolationofMicrosatelliteArrays)方法先用RAPD引物从基因组中获得随机扩增片段，扩增片段经载体克隆后，用特异SSR及载体引物对克隆阵列进行PCR检测筛选含SSR克隆，对阳性克隆测序根据以上两种利用RAPD富集SSR的报道，均避免了基因组文库的构建，有利于节省时间和人力、物力，但基于此方法进行大量SSR分离的成功报道并不多。PIMA(PCRIsolationofMicrosEST-SSR标记的开发数量迅速增加的ESTs为开发新的SSR标记提供了宝贵的资源，各种植物中约有5-10%的EST含有可用于建立标记的SSR建立EST-SSR标记要经济得多；而且EST-SSR标记来源于DNA的转录区域，比gSSR标记具有更高的通用性；功能标记-信息量高开发EST-SSR的基本过程：EST序列的获取与冗余EST序列剔除；SSR的搜寻；SSR的信息统计与分析；SSR引物设计；PCR扩增及扩增产物电泳检测EST-SSR标记的开发EST序列的获取与冗余EST序列剔除公共数据库中已积累了大量的EST序列，这些序列是共享的，可免费下载（如www.ncbi.nlm./projects/dbEST

）采用EST聚类分析软件，剔除冗余ESTSSR的搜寻：利用软件RepeatMasker(可直接登录使用-/cgi-bin/WEBRepeatMasker)

搜索非冗余EST中含有的SSRSSR的信息统计与分析：明确SSR特点SSR引物设计：Primer3（5）（http://frodo./cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）

EST序列的获取与冗余EST序列剔除4584条非冗余白菜EST中SSR的出现频率

重复类型基元种数SSR数目占全部SSR比例（%）出现频率（%）单核苷酸2214.430.46二核苷酸420042.194.36三核苷酸1019240.514.19四核苷酸7132.740.28五核苷酸6173.590.37六核苷酸10234.850.50其它/81.690.17总计40474100.0010.344584条非冗余白菜EST中SSR的出现频率重复类型基元种白菜EST中二核苷酸和三核苷酸重复基元

重复基元

数量发生频率(%)所占比例(%)二核苷酸

GA/TC1433.1271.50AT491.0724.50GT/AC50.112.50GC30.071.50三核苷酸

GAA/TTC721.5737.50TCC/AGG380.8319.79CAT260.5713.54CCA/TGG190.419.90TTG/AAC160.358.33CGG/CCG90.204.69CGA50.112.60CTG40.092.08TCT20.041.04GAT10.020.52白菜EST中二核苷酸和三核苷酸重复基元重复基元数量发生频重复基元

长度(bp)重复性质

变化范围

平均长度)完全重复

不完全重复

总计

二核苷酸12-7927.411684200三核苷酸16-18355.288104192四核苷酸21-17671.88513五核苷酸26-15240.712517六核苷酸18-17482.732023合计12-18344.1227218445白菜EST中SSR的重复长度和性质

重复长度(bp)重复性质变化范围平均长度)完全重复不引物编号重复基元预期产物大小Tm(℃)GC%序列(5’3’)EST-SSRP001

（CTG）24

24459.8845.00AGCTCGTTGGTTCATTTGCT

59.5255.00GCAACCACAGTTACAGCAGCEST-SSRP002

（TC）17

21360.0850.00ACGATGAATCCAGTCAAGGC

59.8345.00TAAAACCCTGTTCGTTTGGGEST-SSRP003

（TC）14

21260.0250.00TTTCTCCGCCAAGTAGTGCT

60.0750.00GACGGTTACGGAATCGAGAAEST-SSRP004

（CAT）7

19960.7245.00TGCTTGCAGAAAGACGAACA

29359.8545.00TTGAGCGTAGGCAGGAAAATEST-SSRP005

（CATA）17

29360.6160.00CACGCCTAGCACTGTCTCCT

59.9355.00GGACTCGATGTAGGGGTTGAEST-SSRP006

（TTC）20

24660.1960.00GGCTCCTCGGTTATAGCCTC

59.9650.00ACCAGCTTCCATCCATAACGEST-SSRP007

（GA）38

25159.8950.00TGGATTAAGACCATCCCGAG

59.8955.00AGAAGGAGCTCTTGTGAGCGEST-SSRP008

（GA）22

22060.7355.00AGATTACTGGAGAAGCCGCC

59.8955.00AGAAGGAGCTCTTGTGAGCG对白菜EST-SSR设计的引物（其中8对）

引物编号重复基元预期产物大小Tm(℃)GC%序列(5’3扩增产物电泳检测

600500400300200teaplantChinesecabbageoilseedrape

扩增产物电泳检测600t分子育种学课件分子标记与植物育种SSR标记的特点(1)数量较为丰富，覆盖整个染色体组(2)具有多等位基因特性，信息含量高(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性(4)易于利用PCR技术分析，对DNA数量及纯度要求不高，结果重复性好(5)每个位点由引物序列顺序决定，便于交换SSR标记的特点分子育种学课件分子标记与植物育种分子育种学课件分子标记与植物育种6）ISSR标记(Inter

SimpleSequenceRepeat，ISSR

）ISSR标记由加拿大Zietkiewicz等(1994)所发展ISSR原理：根据基因组内广泛存在的SSR设计引物，对两侧具有反向排列SSR的一段DNA序列进行扩增，然后进行电泳检测，根据谱带的有无及相对位置来分析多态性。(A)(B)SSR引物6）ISSR标记(InterSimpleSequenceISSR引物组成：16-18个碱基，由2-4个碱基组成的串联重复序列和几个非重复的1-4个锚定碱基组成无锚定碱基引物可与任何位置(TC)结合5’端加2个锚定碱基（NN）引物只能与3’端特异位置(TC)结合3’端加2个锚定碱基（NN）引物只能与5’端特异位置(TC)结合ISSR引物组成：16-18个碱基，由2-4个碱基组成的串联2个ISSR引物的扩增

2个ISSR引物的扩增ISSR标记技术要点引物中串联重复序列的选择：基因组中出现最多的是二、三核苷酸SSR，设计ISSR引物时应与这些序列互补的加锚重复序列为主（单个或两个组合）引物中锚定碱基位置的确定：根据用100个引物对小麦基因组进行扩增，55个引物能扩增，产生多态性最多的是CT、GA、CA和CCT的引物，而且大多数引物是在3’端加锚，只有引物AT是在5’端加锚，在3’端加锚的AT引物没有扩增产物反应条件：同普通PCR一样，也要对反应条件进行优化，主要考虑引物浓度及其退火温度、镁离子浓度、模板浓度。ISSR扩增产物的分离：常用琼脂糖浓度为1.5-2.0%，聚丙烯酰胺浓度为6-8%ISSR标记技术要点ISSR标记优点产物在进行测序胶电泳分离，具有单碱基的高分辨率，遗传信息量大呈孟德尔式遗传，具有很好的稳定性和多态性DNA用量少，技术要求低引物具有通用性ISSR标记技术的缺点由于SSR座位突变率高，对变异反应非常敏感，所以易受到平行演化程度的影响，从而给物种间亲缘关系的评估带来误差针对每个座位测定并找到SSR两端寡聚核苷酸来设计引物，较费时耗力通常为显性标记，不能区分杂合体ISSR标记优点7）单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP）

第三代分子标记技术测序SNP是指基因组内单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括单个碱基的转换(transition，如T→C和A→G)以及颠换(transversion)，而且其中最少一种等位基因在群体中的频率不小于1%。

7）单核苷酸多态性(SingleNucleotidePo转换的发生率总是明显较高：属于转换型变异的SNP约占全部SNP的2/3。在单个基因或整个基因组中SNP的分布不均匀，在非转录序列中要多于转录序列，而且在转录区也是非同义突变的频率比同义突变的频率低得多转换的发生率总是明显较高：属于转换型变异的SNP约占全部S‣不同个体的PCR扩增片段直接测序是发现SNP的最常用方法：利用目的性状相关的基因位点或EST序列设计引物，通过PCR扩增，对PCR产物进行测序，然后应用SNP发现的专业软件Genalys或DNAstar，结合Clustal等软件，分析测序结果，排除测序错误，发现SNP。Nasu等(2002)以水稻3个栽培种和1个野生种为实验材料，对分布于全基因组的417个位点进行SNP研究，发现了2800个SNP，发生频率平均每89bp有一个SNP。Tenaillon等(2001)以25个玉米近等系为材料，对分布在1号染色体上的21个遗传位点序列多样性进行了研究，发现平均每104bp有一个SNP。Kota(2001)等从19000个EST中选择了目的性状相关的EST180个，用7个基因型的大麦进行了研究，发现了72个SNP。开发SNP的方法‣不同个体的PCR扩增片段直接测序是发现SNP的最常用方法：‣基于公共数据库的直接方法：公共数据库中已有大量的EST、STS、cDNA文库和基因组测序公开的序列等信息。在这些序列之间必然存在大量的重叠区域，通过比较这些重叠区域，并运用一些软件删除由测序造成的碱基错读，就可得到候选SNP甚至真正的SNP，这种策略可大大降低成本。利用拟南芥数据库发现了大量SNP，通过http：///cereon/index.html可以查到这些数据。‣基因芯片技术也可用于SNP的开发：Wang等(1998)报道采用DNA芯片技术从16725个STS(包含2Mb的人类DNA)中得到2748个SNP，平均每721bp有一个SNP。‣基于公共数据库的直接方法：公共数据库中已有大量的EST、SSNP的检测几种方法‣SNP检测要求：高通量、敏感、费用低单链构象多态性(SingleStrandConformationPolymorphism)

生物大分子在单链旋转时，由取代基团形成的不同立体结构而产生不同的构象，这种改变不涉及共价键破坏。双链DNA片段形成单链后，在非变性条件下会折叠成不同的空间构象，这种构象会因个别核苷酸的不同而改变，长度相同或相近的单链在电泳时由于构象不同而具不同迁移率，从而显示出多态性。在SSCP分析时，应先将扩增后的DNA片段变性为单链，然后在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳1989年日本Orita等创建SNP的检测几种方法只能提示样本有无突变不能提供具体的突变位置SSCP的技术流程只能提示样本有无突变SSCP的技术流程‣变性高效液相色谱法(denaturinghighperformanceliquidchromatography，DHPLC)通过PCR扩增出包含多态性位点的片段，由带正电荷的流动相将带负电荷的DNA分子吸附到固定相上。在加热部分变性的条件下，由于碱基的错配会形成2种同源双链分子和2种异源杂合双链分子。在相同的部分变性条件下，错配的异源双链DNA更易变性，被色谱柱保留时间短于同源双链DNA。增加洗脱强度时，与固定相亲和力较弱的异源双链将先于同源双链被洗脱出来，从而发现DNA的突变，据此可检测单个碱基置换、插入或缺失杂合二倍体的片段。DHPLC只能提示待测样本有无突变，不能100%检出;对每个DNA片段的分析需要优化相应的运行温度，而不能提供具体的突变类型，必须要测序等后续方法证实。‣变性高效液相色谱法(denaturinghighper‣基因芯片技术(GeneticChips)通过DNA芯片上的固定探针或样品DNA与游离样品DNA或探针杂交来推断未知靶分子，杂交发生与否可采用荧光标记技术来检测。SNPs是二等位基因遗传标记，所以筛查SNPs只需要做阳性／阴性分析，而不必分析片段长度。只需观察芯片杂交结果是阳性或阴性，就能对SNPs作出判断。利用DNA芯片技术一次可以对大量DNA分子进行检测分析，自动化程度高，易实现高通量，是SNPs位点分析的未来的趋势之一。但首先必需制备芯片，费用高，只能检测出约50%。‣基因芯片技术(GeneticChips)‣毛细管电泳技术毛细管电泳是近年出现的高效、快速分离分析技术，泛指在散热效率高的20～100μm

的细管内，利用筛选机制和高强度电场的双重作用下，DNA片段因离子表面积和分子外形变异导致迁移时间的不同来检测SNP这一技术省时、省力。能在20min内分离长至数千的碱基片段，还可以同时处理多个样品，相对减少操作时间及工作量，而且适合于自动化的要求不能提供具体的突变位置‣毛细管电泳技术不能提供具体的突变位置‣

酶学检测技术酶学突变检测的建立依赖于特异性核酸酶的发现一些核酸酶，如核糖核酸酶、T4内切酶CELI、S1等可识别异质双链DNA中的碱基错配，并在错配的碱基处进行剪切。根据这一特性，可不同个体同一基因或基因片段进行PCR，然后将扩增产物混合，进行变性、复性和核酸酶切处理，电泳后可检测出由于SNP而形成的碱基错配。S1核酸酶——较长DNA片段，定位变异位点，但反应难以控制，酸性条件易发生非特异性的降解双链DNA，不能对单个错配碱基进行有效地切割；RNase——大片段检测，并能确定突变位点，但需要制备特异性RNA探针，且只有70%的突变检出率；T4内切核酸酶——能识别的是结构而不是序列，大片段检测，检出率高，但非特异性切割同源体，产生非特异性背景条带‣酶学检测技术利用芹菜核酸酶CELI检测点突变利用芹菜核酸酶CELI检测点突变‣其它检测技术直接测序法：通过对片段进行测序和序列比较，检出率可达100％。最可靠，但成本高、费时限制性酶切分析：如果SNP产生或消除了某个限制性内切酶位点，则可以利用限制性内切酶对PCR产物进行酶切，电泳后检测；估计有半数的SNP并不导致酶切位点的改变，在PCR中引入错配引物可克服这一不足。该方法适宜于非大量的寻找或检测质谱技术也可以用于检测SNP，但需要将目的片段转化为DNA/RNA镶嵌结构，在分析之前还需要用四种核酸酶进行预处理，费用高；依赖于变性动力学的PCR技术也能用于SNP的检测，只适合于对小片段的分析‣其它检测技术SNP特点数量多，分布广泛：是目前为止分布最为广泛、存在数量最多且标记密度最高的一种遗传多态性标记。在Arabidopsis的92.1Mb中发现了25274个SNP，平均为1SNP/3.3kb；对CBF1、CBF2和CBF3位点区域的3907bp，编码区域平均1SNP/33bp，5‘端非编码区平均1SNP/29bp，3'端非编码区平均1SNP/47bp.遗传稳定性高，遗传分析重现性好且准确性高：SNP标记的遗传稳定性要比SSR等标记高得多，而且在群体中也是按孟德尔规律遗传易于快速且高通量地进行基因型分型：由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组中往往只需＋/－的分析，而无须象检测SSR标记那样分析片段的长度，这就有利于自动化的筛选或检测技术的开发。但开发SNP需要依赖于测序，受测序的准确性的影响SNP特点SNPinthealkgenecodingregionsindifferentkindsofriceSNPinthealkgenecodingreg8）相关序列扩增多态性(Sequence-relatedAmplifiedPolymorphism，SRAP)

2001年建立，又叫基于序列扩增多态性(sequence-basedamplifiedpolymorphism，SBAP)新型的基于PCR的标记。TheoreticalAndAppliedGenetics（103:455-461）SRAP标记的引物设计原理

SRAP引物设计是其分析的核心。共有两套引物。在一组正向SRAP引物中使用CCGG序列，其目的是使之特异结合阅读框(ORFs)区域中的外显子（外显子一般处于富含GC区域）；富含AT的区域序列通常见于启动子和内含子中,SRAP中使用的反向引物的3′端含有核心AATT,以特异结合富含AT区,这就使得有可能扩增出基于内含子与外显子的SRAP多态性标记。8）相关序列扩增多态性(Sequence-relatedSRAP引物设计与应用：大小和引物组合是成功分析的关键SRAP-PCR反应体系中使用两个引物核心序列(core-sequence)14bp

:

“填充”序列(fillersequence)10bp(无任何特异组成)+CCGG选择性碱基:3′端的3bp,选择性碱基的变化与相同核心序列组合成一套正向引物。对正向与反向引物的总体要求是它们不形成发夹结构及其他二级结构，且CG含量为40%～50%，且两者填充序列在组成上必须不同，长度为10-11bp正向引物17bp：5’-TGAGTCCAAACCGGATA-3’反向引物18bp：5’-GACTGCGTACGAATTAAT-3’SRAP引物设计与应用：大小和引物组合是成功分析的关键正向引文献中报道的SRAP部分标准引物序列文献中报道的SRAP部分标准引物序列

SRAP-PCR扩增反应模板多数是基因组DNA,也可以是cDNA标准SRAP-PCR反应体系与普通相同SRAP-PCR反应采用复性变温法:开始94℃变性5min；反应前5个循环在94℃1min-35℃1min-72℃1～2min；随后30～35个循环复性温度提高到50℃,最后延伸5～7min前5个循环复性温度设为35℃，是考虑到低复性温度能确保两个引物与靶DNA部分配对；随后循环中复性温度升到50℃,可保证前5个循环的扩增产物可在余下循环中进行指数式扩增；如果复性温度在40个循环中都保持在35℃，扩增片段重复性将很低。SRAP-PCR扩增

SRAP标记特征正反引物分别是针对序列相对保守的编码区与变异大的内含子、启动子和间隔序列，故多数SRAP标记在基因组中分布均匀；无需知道序列且可以克隆根据对130个SRAP标记的研究约20%为共显性，则明显优于AFLP标记；不同实验中重复性极好SRAP标记测序显示多数标记为外显子区域，Blast搜索表明60%条带与已知基因序列高度一致,这就确认了SRAP产生的多数标记包含了ORF中的外显子多态性产生：由于小的插入与缺失导致片段大小改变，而产生共显性标记；核苷酸改变影响引物的结合位点，导致显性标记产生。SRAP标记特征孔雀草一串红孔雀草一串红9）靶位区域扩增多态性(TargetRegionAmplifiedPolymorphism,TRAP)美国农部北方作物科学实验室Hu等2003年提出，也是一种新型的基于PCR标记，从SRAP技术改进而来PlantMolecularBiologyReporter,2003,

21:289-2949）靶位区域扩增多态性(TargetRegionAmpTRAP的引物设计与反应条件TRAP使用长度为16～20bp的固定引物与任意引物固定引物：以公共数据库中的靶EST序列设计而来;采用引物设计软件(如Primer3等)设定核苷酸序列合理长度(18bp)与最适、最大和最小Tm值(53、55、50℃)，选定最适的引物任意引物：A:5端填充序列；B:

4-6个以AT或GC为核心的碱基；

C:

3端3-4个选择性碱基。随机序列TRAP-PCR反应条件与SRAP-PCR基本一致FP:5-TGTCATTCAATTCGGTGC-3AP:5-CTATCTCTCGGGACCAAA-3TRAP的引物设计与反应条件TRAP使用长度为16～20萝卜抗病基因类似物的TRAP标记向日葵杂种及保持系的TRAP分析萝卜抗病基因类似物的TRAP标记向日葵杂种及保持系的TRAPEST-PCR标记是EST计划衍生的产物EST标记：根据EST本身的差异而建立的标记建立EST标记的策略：A）用其做探针，建立EST-RFLP标记；B）根据EST的序列设计引物，对基因组特定区域进行特异性扩增，EST-PCR、EST-SSR标记；C）比较序列差异：EST-SNP标记通用性较高，但在种内揭示的多态性能力低提高措施：A）设计引物时尽量靠近5’或3’端非翻译区；B）扩增片段的酶切；C）PAGE分析10)EST-PCR标记（ExpressedSequenceTagsPCR，EST-PCR）EST-PCR标记是EST计划衍生的产物10)EST-PC白菜EST-PCR引物的筛选及2对引物P003和P031在不同品种间显示的的多态性白菜EST-PCR引物的筛选及2对引物P003和P03111)SCAR（SequenceCharacterizedAmplifiedRegionSCAR）SCAR标记是Paran等（1993）提出的特异引物PCR标记原理：由RAPD标记转化而来的，为了提高RAPD标记的稳定性，将RAPD片段回收并进行克隆和测序，根据其碱基序列设计一对特异引物，或根据其末端序列在原随机引物上增加相邻的14个左右碱基，成为与原RAPD片段末端互补的特异引物。以此特异引物对基因组DNA再进行PCR扩增，便可扩增出与克隆片段同样大小的特异带SCAR标记一般表现为扩增片段的有无，是显性标记；但有时也表现为长度的多态性，为共显性的标记。对前者可直接在PCR反应管中加入溴化乙锭，在紫外灯下观察有无荧光来判断有无扩增产物，从而检测DNA间的差异，这样可省去电泳的步骤，使检测变得方便、快捷、可靠；相对于RAPD标记，结果稳定性好、可重复性强

11)SCAR（SequenceCharacterize紫丁香蘑接合型SCAR标记紫丁香蘑接合型SCAR标记12)序列标签位点标记（SequenceTaggedSite，STS）STS技术是基于RFLP发展起来的标记技术，Olson等(1989)首先在人类基因组的物理图谱研究中使用它STS原理：根据单拷贝的DNA片段两端的序列，设计一对特异引物，扩增基因组DNA而产生的一段长度为几百bp的特异序列。STS标记采用常规PCR所用的引物长度，因此PCR分析结果稳定可靠。RFLP标记经两端测序，可转化为STS标记。STS在基因组中往往只出现一次，从而能够界定基因组的特异位点。STS标记可作为比较遗传图谱和物理图谱的共同位标12)序列标签位点标记（SequenceTaggedS水稻STS标记图例水稻STS标记图例13）切割扩增多态序列

（Cleaved

Amplified

Polymorphic

Sequences，

CAPS）CAPS标记建立于1993年，是特异引物PCR与限制性酶切相结合而产生的一种DNA标记，它实际上是一些特异引物PCR标记的一种延伸，当使用SCAR、STS或EST标记不表现多态性时，一种补救办法就是用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，然后再通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性，用这种方法检测的DNA多态性即CAPS标记。CAPS揭示PCR产物DNA序列内限制性酶切位点变异的信息，表现为限制性片段长度的多态性—共显性13）切割扩增多态序列（CleavedAmplifiedCAPS的多态性产生图例CAPS的多态性产生图例14）dCAPS

标记（DerivedCleavedAmplifiedPolymorphicSequence）NeffMMetal(1998):ThePlantJournal,14(3):387–392原理：SNP不在限制性酶切位点上，可在CAPS

标记的基础上通过在扩增引物中引入错配碱基，则可以结合SNP引入新的限制性内切酶作用位点，产生与CAPS类似的标记用CAPS或

dCAPS

的方法则可以将几乎所有的SNP位点转化成以PCR为基础的分子标记。

dCAPSFinder214）dCAPS

标记NeffMMetal(1998UncutMnlIBslI引入错配UncutMnlIBslI引入错配15）SCoT(目标起始密码子多态性)标记(startcodontargetedpolymorphism，SCoT)Collard和Mackill(2009)开发原理：其依据植物基因中的ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性，设计单引物并对基因组进行扩增。与RAPD等一样，单引物同时充当上下游引物的作用，不同的是SCoT单引物可同时结合在双链DNA的正负链上的ATG翻译起始位点区域，从而扩增出两结合位点之间的序列15）SCoT(目标起始密码子多态性)标记SCoT标记的引物设计要求以ATG中的A为下游+1位置，+4位置是G，+7位置是A，+8、+9位置是C,其他位置为填充序列；引物长度为18bp，GC含量在50-72%，无兼并碱基。ATGGXXACCCAACAATGGCTACCACCG按ATG翻译起始位点侧翼保守性设计SCoT标记的引物设计要求以ATG中的A为下游+1位置，+SCoT的扩增：PCR组成：1.5mmol/LMgCl2，引物0.8mol/L，dNTP0.24mmol/L,DNA聚合酶1-2U，模板25-50ng。反应条件：是94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃(统一温度)退火1min，72℃延伸2min，共35个循环；72℃延伸5min。延伸温度时间的长短较为关键，时间不能太短，时间太短不能有效地扩增出距离较远的两结合位点之间的序列。尽管退火温度高能提高重复性，但退火温度不超过55℃。检测：可用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；每个反应一般产生5～10条带(琼脂糖胶检测)，大小多在200-1500bp之间特点：操作简便；基于表达基因的功能标记；大部分是显性标记，少数共显性；引物设计简单，但重复性较高。SCoT的扩增：孔雀草SCoT标记孔雀草SCoT标记16）抗病基因类似物标记（ResistanceGeneAnalogs，RGA）测序与PCR技术相结合的标记，来源于抗病基因原理：对已克隆的植物抗病(R)基因分析发现,来自不同植物的不同抗病基因都具有一些共同的保守序列，依据基因保守序列设计特异引物来扩增基因组DNA可获得抗病基因类似物(RGA)片段。这些RGA既可以作为一种基于特异引物PCR的DNA标记，其本身又是潜在的（侯选的）抗病基因。RGA扩增技术是寻找抗病基因DNA标记的一种有效手段16）抗病基因类似物标记（ResistanceGeneA几种分子标记的比较

比较内容RFLPRAPDAFLPISSRSSR核心技术电泳杂交电泳电泳电泳电泳多态性类型突变、缺失、重复、易位、倒位单碱基突变、缺失、重复、易位、倒位突变、缺失、重复、易位、倒位重复序列间的长度或有无重复序列长度与次数的差异多态性水平低低高高高技术难度高低中低低可靠性高低高高高遗传特性共显性显性共显-显性显性-共显共显性探针或引物单,低拷贝序列探针

10bp随机引物

酶切位点接头引物

重复序列和锚定碱基旁邻序列引物

DNA要求大、高小、中中、高小、中小、中标记需求标记探针不需标记标记引物不需标记不需标记费用高低中低低几种分子标记的比较比较内容RFLPRAPDAFLP形态低级间接粗略分子高级直接精确1980198719891990-19951997-19992000-2006RFLPSSCP、STSPCRRAPD、AFLP、DAFSSR、ISSR、SCAR、CAPsdCAPsRetroMSRAP、TRAPSCoT2009SNP、EST-SSR、In/del植物遗传标记的发展历程1900-1910形态标记1941-1960生化标记DNA分子模型1911-细胞学标记形态分子198019871989199019972000RF1、传统选择(表型选择)的缺陷传统育种方法:

根据表型变异选择植物的表现型=遗传因子+环境条件基因效应：质量性状——显性基因与隐性基因；

数量性状——加性效应、显性效应、上位性效应表型常常包含着诸多环境效应的成份，往往给基因型效应蒙上一层“假象”。

选择的预见性差、工作量大，育种周期长建立遗传标记：提高选择效率和育种效果

(三)、分子标记辅助选择

（Marker-assistedSelection）

1、传统选择(表型选择)的缺陷(三)、分子标记辅助选择

（M2、分子标记辅助选择及其优越性概念：根据与目标性状紧密连锁的分子标记，选择具有控制目标性状基因的理想植株，即利用分子标记对育种材料进行的选择。优势：1)克服性状表现型鉴定的困难2)可进行早期选择3)控制单一性状的多个（等位）基因的利用4)可同时选择多个性状5)可进行非破坏性评价和选择6)可加快育种进程，提高育种效率

间接选择其它基因环境条件2、分子标记辅助选择及其优越性间接选择3、分子标记辅助选择的基本步骤建立的标记辅助选择系统的要求：①标记与目标性状共分离或紧密连锁直接/间接选择

准确②易于在大群体进行筛选的标记检测手段

选择对象快速检测

自动化③成本低、重复性好成本低

DNA用量小基于PCR的标记3、分子标记辅助选择的基本步骤建立的标记辅助选择系统的要求：分子标记辅助选择的基本步骤

确定目标性状：可根据育种目标来确定所要选择的性状

控制目标性状的基因定位：群体（F2、BC1、DH、RIL）容量>100个,根据群体中目标性状与标记的共分离情况进行定位。建立以PCR为基础的分子标记建立骨干亲本的数据库分子标记辅助选择的基本步骤确定目标性状：可根据育种目标来确4、质量性状的标记辅助选择重要的农艺性状抗病、抗虫、育性、部分株高显性--隐性杂合--纯合抗病、抗虫性表型选择结果可靠创造适宜条件人工培养和接种表现型测量困难个体发育后期才能测量遗传背景选择主基因--微效基因控制（易受环境影响，如抗病性）4、质量性状的标记辅助选择重要的农艺性状抗病、抗虫、育性（1）对质量性状进行标记的目的与方法主要目的对质量性状进行标记辅助选择对质量性状基因进行图位克隆。主要方法近等基因系分析法：采用近等基因系分离群体分组混合分析法：根据分离群体表型或基因型分组已有连锁群法：根据已有连锁图谱寻找标记（1）对质量性状进行标记的目的与方法近等基因系法（Muehlbauer1988）近等基因系（near-isogenicline，NIL）：一组遗传背景相同或相近，只在个别染色体区段上存在差异的株系基本原理：比较轮回亲本、NIL及供体亲本三者的标记基因型，当NIL与供体亲本具有相同的标记基因型，但与轮回亲本的标记基因型不同时，则该标记就可能与目标基因连锁近等基因系法（Muehlbauer1988）近等基因系（近等基因系分析法应用利用NIL方法对寻找与目标基因紧密连锁的分子标记是十分有效的，这类标记不仅适合于标记辅助选择，对利用图位法克隆目标基因也是十分有用的。Young和Tanksley(1989)找到了与番茄抗烟草花叶病毒病抗病基因Tm-2相距不到0.5cM的DNA标记Paran等（1991）用NIL鉴别了4个RFLP、4个RAPD标记与莴苣霜霉病抗性基因Dm1和Dm3连锁，6个RAPD标记与Dm11连锁Martin等（1991）鉴定出与番茄青枯病病抗性基因Pto相连锁的3个RAPD标记。近等基因系分析法应用分离群体分组混合分析法Michelmoreetal.1991BSA（BulkedSegregateAnalysis）法是从NIL法演化而来，克服了没有或难以创建相应NIL的限制BSA法根据分组混合的方法不同可分为基于性状表现型和基于标记基因型二种。基于性状表现型的BSA：根据目标性状的表现型对分离群体进行分组混合的。基于标记基因型的BSA法：根据目标基因两侧的分子标记的基因型对分离群体进行分组混合。适合于目标基因已定位在连锁图上，但侧标记与目标基因之间相距还较远，需要寻找更为紧密连锁的标记分离群体分组混合分析法Michelmoreetal.1基于性状表现型BSA的原理：在分离群体中，依据目标性状表型的相对差异，将个体或株系分成两组，分别将两组中的个体或株系的DNA混合，形成相对的DNA池。两DNA池间差异相当于两近等基因系之间的差异，仅目标区域不同，而整个遗传背景是相同的。因此，在这两个DNA池间表现出多态性的DNA标记，就有可能与目标基因连锁在检测两DNA池之间的多态性时，通常应以双亲的DNA作对照，以利于对实验结果的正确分析和判断。为了可靠起见，在用BSA法获得连锁标记后，最好再回到群体上根据分离比例进行验证，同时也可估算出标记与目标基因间的图距基于性状表现型BSA的原理：在分离群体中，依据目标性状表型的R/Rr/rRrP:F2:F1:RrR/Rr/rRrP:F2:F1:Rr抗

感杂杂杂

感杂

抗

感

杂

抗杂杂抗

感分离群体分子标记辅助选择抗性鉴定结果抗感杂杂杂感杂抗感杂基于标记基因型BSA法的原理假设已知目标基因座位于两标记座位A和B之间，记来自亲本1的标记等位基因为A1和B1，来自亲本2的为A2和B2。那么，在某个分离群体中，标记基因型为A1B1/A1B1的个体中，目标区段将基本来自亲本1，而A2B2/A2B2个体中的则基本来自亲本2，除非在该区段上发生了双交换，而发生双交换概率很小。因此，可以将群体中具有A1B1/A1B1和A2B2/A2B2基因型的个体的DNA分别混合，构成一对近等基因DNA池，它们只在目标区段上存在差异，而在目标区段之外的整个遗传背景是相同的获得连锁标记后，还可以进一步分析它在群体中的分离情况，进行验证，并确定它在目标区段中的位置基于标记基因型BSA法的原理近等基因系分析法和分离体分组混合分析法只能对目标基因进行分子标记，但还不能确定目标基因与分子标记间连锁的紧密程度及其在遗传连锁图上位置，而这些信息对于估价该连锁标记在标记辅助选择和图位克隆中的应用价值是十分必需的。因此，在获得与目标基因连锁的分子标记后，还必须进一步利用作图群体将目标基因定位分子连锁图上。定位方法与经典遗传学的方法完全一样。迄今为止，利用分子标记和各种不同的作图群体，在植物中已定位了大量的质量性状基因或主基因近等基因系分析法和分离体分组混合分析法只能对目标基因进行分子（2）质量性状标记辅助选择的方法①前景选择法（foregroundselection;Hospital等1997）

间接选择标基因，是MAS的主体。前景选择的可靠性主要取决于标记与目标基因间连锁的紧密程度。若只用一个标记对目标基因进行选择，则标记与目标基因间的连锁必须非常紧密。采用双标记可提高选择效率。

（2）质量性状标记辅助选择的方法p=(1-r)2单标记n=Log(1-P)/Log(1-p)双标记选择正确率：最少选择株数：p=(1-r1)2(1-r2)2/[(1-r1)(1-r2)+r1*r2)]2至少选到1株目标个体的概率p=(1-r)2单标记n=Log(1-P)/Log(1-p)②背景选择法（backgroundselection;Hospital等1997）

背景选择：对基因组中除目标基因外的其它部分的选择与前景选择不同，背景选择的对象几乎包括了整个基因组，因此，牵涉到全基因组选择的问题。要对整个基因组进行选择，就必须知道每条染色体的组成。这就要求用来选择的标记能够覆盖整个基因组，也就是必须有一张完整的分子标记连锁图。图示基因型：根据标记的来源，推测出一个反映全基因组组成状况的连续的基因型，用计算机程序将这种连续的基因型用直观的图形表示出来。指导背景选择先前景选择，后背景选择②背景选择法（backgroundselection;

亲本A亲本BChr1Chr2……M1BM2AM3BM4AM5AM6……….…….图示基因型示例亲本A亲本BChr1Chr2……M1BM（3）基因聚合（genepyramiding）将分散在不同品种中的有用基因聚合到同一个基因组中通常只前景选择（抗病）C101LACC101A51C101PKT抗稻瘟病基因聚合Pi-1Pi-2Pi-4（3）基因聚合（genepyramiding）C101LA（4）基因转移（genetransfer）基因转移或基因渗入（