微生物发酵制药技术基础-培养基和设备的灭菌

项目二培养基和设备的灭菌单元二微生物发酵制药技术基础任务二培养基灭菌的原理在发酵工业中，对培养基和发酵设备的灭菌，广泛使用湿热灭菌法。当培养基被加热灭菌时，常会出现这样的矛盾：加热时，微生物固然会被杀死，但培养基中的有用成分也会随之遭到破坏。因此，必须选择一个既能满足灭菌需要，又可使培养基的破坏尽可能少的灭菌工艺条件。致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物需要的时间。热阻：对热的抵抗力，指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻：微生物对热的相对抵抗能力。指微生物在某一特定条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。（一）微生物的热阻N—残存的活菌数；t—灭菌时间（s）；K—灭菌速率常数（s-1），或比死亡速率常数，此常数的大小与微生物的种类与加热温度有关；dN/dt—活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。（二）对数残留定律

1.灭菌时间的确定

微生物受热死亡的主要原因是高热能使蛋白质变性，这种反应可认为是单分子反应，死亡速率可视为一级反应。

微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比。灭菌时间的确定：对数残留定律

t取决于污染程度N0灭菌的程度Ns：Ns=0，t→∞；工程设计常用Ns=10-3个/mL，也就是每处理1000批培养基只允许残留一个活的微生物或1000次灭菌操作中有一次失败。

只有相对无菌，没有绝对无菌。灭菌速率常数k：是微生物耐热性的特征，k的大小与微生物的种类和灭菌温度有关。

2.死亡速率常数k

灭菌速率常数k是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据，随微生物种类和灭菌温度而异。同一温度下，不同微生物的k值不同，k值愈小，微生物愈耐热。同一种微生物，灭菌温度越低，k值越小；灭菌温度越高，k值越大。因此，提高灭菌温度，k值增大，灭菌时间t显著缩短。A---频率常数，也称阿累尼乌斯常数，s-1；R---气体常数，8.314J/mol·K；T---绝对温度，K；ΔE---微生物死亡活化能，J/mol。或培养基成分分解所需活化能K—灭菌速率常数（s-1），或培养基内易被破坏成分的分解速率常数微生物的受热死亡及培养基受热破坏都属于单分子反应，符合一级反应动力学，两个方程中的速率常数K与温度之间的关系可用阿累尼乌斯公式表示：从上式可知，K值的大小与微生物或营养成分的种类与加热温度有关3.灭菌温度的选择温度为T1时，（2-9）温度为T2时，

（2-10）上述两式相除后，取对数得（2-11）培养基灭菌时，当加热温度由T1升至T2时，微生物的死亡速率常数k的变化情况为：对培养基成分的破坏而言，同样有：（2-12）灭菌时杀死微生物的活化能大于培养基成分的破坏活化能能，因此：

即随着温度的上升，微生物的死亡速率常数增加倍数要大于培养基成分破坏速率的增加倍数。从上述的分析可知，在热灭菌过程中，同时会发生微生物死亡和培养基破坏这两种过程。温度升高，菌体死亡速率大于培养基成分破坏的速率。灭菌温度（℃）灭菌时间（min）维生素B1的破坏量（%）1001101201301451504003640.50.080.0199.367.027.08.02.0＜1.0不同灭菌温度、时间与培养基成分破坏情况（Ns/No=10-3）灭菌温度越高，培养基达到完全灭菌所需时间越短，营养成分的破坏量也越少。提高灭菌温度，缩短灭菌时间，可达到相同的灭菌效果，并有利于减少培养基中营养物质的破坏。因此发酵培养基通常采用高温短时的灭菌方法。灭菌要达到杀死99.99%的细菌芽孢，有两种方法可以采用，一种是118℃灭菌15min，另一种是128℃灭菌5min。哪一种方法好，为什么？问题（三）影响灭菌的因素污染杂菌的种类、数量灭菌温度、时间（三）影响灭菌的因素培养基成分、物理状态脂肪、糖分和蛋白质等有机物增加微生物细胞的耐热性，高浓度盐类、色素等的存在会削弱微生物细胞的耐热性。固体培养基灭菌时间要比液体培养基灭菌时间长。培养基的pH值pH值6.0～8.0，微生物最耐热；培养基的pH值愈低，灭菌所需时间愈短培养基中微生物数量微生物数量越多，达到灭菌效果所需的时间愈长微生物细胞含水量、菌龄

微生物细胞所含水分越多，则蛋白质凝固温度越低，微生物细胞愈易受热而丧失生命力。年老细胞含水量低，对不良环境的抵抗能力比年轻细胞强。微生物的耐热性

芽孢＞孢子＞营养体空气排出情况搅拌、泡沫

实际生产中应防止突然减少进汽或加大排汽，减少进排汽不平衡，防止泡沫的大量生成，同时对极易发泡的培养基应加少量消泡剂减少泡沫量。项目二培养基和设备的灭菌单元二微生物发酵制药技术基础任务三培养基灭菌方法（一）分批灭菌分批灭菌：分批灭菌就是将配制好的培养基全部输入到发酵罐内或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起加热至灭菌温度后维持一定时间，再冷却到接种温度，也称为间歇灭菌，实罐灭菌或实消，是中小型发酵罐通常采用的一种培养基灭菌方法。分为三个阶段：升温、保温和冷却。实罐灭菌是典型的分批灭菌。全过程包括升温、保温、降温三个过程

培养基的配制及输送：在配制罐中按照培养基配方配制培养基后，通过专用管道输入发酵罐中。灭菌前准备工作：开始灭菌时，将发酵罐的空气分过滤器进行灭菌，用压缩空气将分过滤器吹干，保压。放去夹套或蛇管中的冷却水，开启排气管阀。1.操作方法加热（1）预热开启搅拌，在夹套或蛇管中通入蒸汽进行间接加热，培养基的温度达到90℃左右时，停止搅拌，关闭夹套蒸汽阀门。预热的目的防止直接导入蒸汽时由于培养基与蒸汽的温度过大而产生大量的冷凝水使培养基稀释防止直接导入蒸汽所造成的泡沫急剧上升而引起的物料外溢。1.操作方法（2）三路进汽从空气管、取样管、放料管蒸汽旁通阀门向罐内直接通入蒸汽，排气管冒出大量蒸汽后，打开接种、补料、消泡剂、酸碱等管道阀门，调节好各排汽和进汽阀门的开度，使培养基温度达到120℃，1×105pa。三路进汽：蒸汽直接从空气管、取样管、放料管蒸汽旁通阀门进入罐内直接加热图2-4分批灭菌设备示意图保温：调节好各进汽和排汽阀门开度，使罐压和温度保持在120℃、1×105pa。凡进口在培养基液面下的各管道（空气、取样、排料）都应通入蒸汽，在液面上的各管道（接种、补料、消泡剂、酸碱补料等）则应排放蒸汽，保证灭菌彻底，不留死角。1.操作方法冷却：先关闭发酵罐顶部各路进料管道上的阀门，然后依次关闭放料管路、通风管路、取样管路上的阀门。保持罐顶的排气阀排蒸汽，使压力降低至0.05MPa时，打开通风管路上各空气阀，进无菌空气保压，一般调节罐压在0.1MPa左右。

再在夹套或蛇管中通入冷水，培养基温度降至70-80℃后，开搅拌，继续降温。使培养基温度降到所需要的温度。1.操作方法需注意问题配制的培养基体积应准确培养基灭菌前，要对发酵罐进行空消，对pH、DO传感电极进行校正夹套内可通入蒸汽对培养基进行间接加热（预热），也可通入冷却水使培养基降温，这两个过程均需进行搅拌，但必须在70-80℃下才能搅拌。在加热和保温过程中应使所有与发酵罐相连的管道中都有蒸汽通过，不留死角。加热和保温过程中，防止突然开大或关小进汽、排汽阀门，避免大量泡沫产生。冷却阶段，注意保压，防止二次污染3.培养基分批灭菌的优点设备要求低，不需另外设置加热冷却装置；操作要求低，适于手动操作；适合于小批量生产规模；适合于含大量固体物质的培养基灭菌。4.培养基分批灭菌的缺点培养基营养物质损失较多，灭菌后培养基质量下降；需反复进行加热和冷却，能耗较高；不适合于大规模生产过程的灭菌；加热和冷却所需时间较长，增加了发酵的准备时间，就相应地延长了发酵周期，使发酵罐得利用率降低。（二）连续灭菌将配制好的培养基通过专门设计的灭菌器，进行连续流动灭菌后，进入预先灭菌过的发酵罐中的灭菌方式，也称为连消。

依设备和工艺条件的不同，连续灭菌分：连消塔加热的连续灭菌流程喷射加热器加热的连续灭菌流程薄板换热器加热的连续灭菌流程1.连消塔加热的连续灭菌流程这是国内味精厂普遍采用的连续灭菌流程。培养基用泵打入连消塔与蒸汽直接混合，在连消塔内的停留时间为20～30s，达到灭菌温度132℃。再送入维持罐保温，时间8～25min，最后由喷淋冷却器冷却至后续的发酵或培养温度。

缺点：设备较庞大；维持罐直径较大，不能保证物料先进先出，易发生局部过热或灭菌不足的现象；喷淋冷却管道很长，对于黏度较高、固形物含量较多的培养基极易堵塞。2.喷射加热器加热的连续灭菌流程优点：能保证培养液在喷射加热器和维持管中的先进先出，避免了培养基过热和灭菌不彻底现象，培养基总的受热时间短，营养物质的损失不严重。缺点：真空冷却系统要求严格密封，以免重新污染。3.薄板换热器加热的连续灭菌流程

薄板换热器由于具有设备紧凑、占地面少、拆洗方便、传热面积和传热系数高、不使热敏物料产生局部过热现象等优点，被广泛用于食品、发酵、制药、化工部门作为加热、冷却或灭菌之用。采用板式换热器的连续灭菌流程，生培养液进入板式换热器的热回收与熟培养液先进行一次热交换达到预热，以便提高热量的利用率，然后进入加热阶段到灭菌温度后引入维持器进行保温，灭菌好的熟培养液再进入热回收段作为生培养液的加热介质，同时本身也得到一定程度的冷却，最后进入冷却阶段用冷却水冷却到所需培养温度。板式换热器的特点是：培养基在设备中同时完成预热、灭菌及冷却过程。虽然加热和冷却生培养液所需时间比使用喷射式连续灭菌较长，但灭菌周期比分批灭菌小得多。由于生培养基的预热过程即灭菌培养基的冷却过程，所以节约了蒸汽及冷却水的用量，板式换热器的缺点是制造加工复杂，必须有专业厂成批生产，密封要求高，密封填圈易损坏，需经常调换。连续灭菌的优缺点优点短时间内加热到保温温度且能快速冷却，减少养分的损失操作条件恒定，灭菌质量稳定易于实行管道化和自动化控制避免反复加热和冷却，提高了热利用率发酵设备利用率高缺点设备要求高，需另外设置加热冷却装置操作比较麻烦染菌机会多对蒸汽要求高不适合大量固体物料的灭菌注意问题连续灭菌前发酵罐应进行空消连续灭菌流程中使用的加热器、维持器、冷却器等应先进行清洗和灭菌培养基灭菌前应先预热耐热性物料和不耐热性物料可在不同温度下分消项目二培养基和设备的灭菌单元二微生物发酵制药技术基础任务四设备和管道的灭菌种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等空罐灭菌

从各罐底部的有关管道通入蒸汽，使罐内压力达0.147MPa，维持45min。灭菌完毕，关闭蒸汽阀后，待罐内压力低于空气过滤器压力时通入灭菌空气保压至0.098MPa。空气总过滤器和分过滤器灭菌

从空气过滤器上部通入蒸汽，并从上、下排气口排气，维持压力0.147MPa，灭菌2h。灭菌完毕，通入压缩空气将空气过滤器吹干，然后保压。补料管路，消沫剂管路灭菌

可与补料罐、消沫剂罐同时进行灭菌，但保温时间为1h。接种管路灭菌一般要求蒸汽压力0.3～0.45MPa，保温1h。项目二培养基和设备的灭菌单元二微生物发酵制药技术基础任务五其他物料和实验用具的灭菌条件灭菌锅灭菌条件：固体培养基0.098MPa，20-30min；液体培养基0.098MPa，15-20min；玻璃器皿及用具0.098MPa，30-60min种子培养基实罐灭菌条件：121℃，30min消泡剂灭菌条件：121℃，30min尿素溶液灭菌条件：105℃，5min补料实罐灭菌条件：淀粉液121℃，5min

糖液120℃，30min项目二培养基和设备的灭菌单元二微生物发酵制药技术基础任务一灭菌的方法培养基灭菌的定义是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。热灭菌法(干热、湿热和火焰灭菌法)射线灭菌法臭氧灭菌法化学试剂灭菌法过滤除菌法(阻留微生物，达到除菌的目的)

（一）干热灭菌法

160℃，1-2h。使微生物体内的蛋白质发生氧化作用而死亡。用于玻璃和金属器皿的灭菌。（二）湿热灭菌法湿热灭菌法：利用饱和蒸汽灭菌。使微生物体内的蛋白质发生凝固作用而致死。由于蒸汽有很强的穿透力，冷凝时放出大量的潜热，来源方便，价格低廉，灭菌效果好，是目前最基本的适合培养基和设备的灭菌方法。一般条件为：121℃，30min。用于生产设备、培养基、管道、阀门、流加物料等的灭菌。（三）射线灭菌法原理：利用高能电子波、紫外线或放射性物质产生的高能粒子，可以穿透微生物细胞而达到灭菌的方法。常用的射线有：宇宙线（0.0001～0.1Å）、γ射线、x射线、紫外线、高速电子流的阴极射线等。适用范围有限，只用于无菌室、无菌箱等局部空间和器皿等的表面消毒。（四）化学试剂灭菌法消毒剂用途常用浓度使用方法1