竹杖菌丝中邻苯二甲酸二丁酯的富集作用

竹杖菌丝中邻苯二甲酸二丁酯的富集作用

竹荚是一种食用的真菌。目前,对DBP的研究主要集中于水、土壤、食品以及对人体的毒性作用,而对药用植物、真菌中的DBP研究较少。关于对竹荪菌丝中DBP的富集作用研究未见报道,因此,本课题研究旨在通过有机溶剂对不同生长时间竹荪菌丝进行提取,采用GC-MS分析测定,外标法定量。并做相应空白对照,确定不同生长时间竹荪菌丝、培养液及空白培养液中DBP的含量。并对三者中DBP含量进行分析比较,判断竹荪菌丝对DBP是否具有富集作用,对竹荪产品的质量保证和拓展开发潜能具有重要现实意义,为进一步带动竹荪种质的多方向开发利用提供科学依据。1材料和方法1.1甲酸二丁酯标准品、试剂与仪器竹荪菌丝:贵州省榕江县野生竹荪转接保存菌丝;培养基:综合马铃薯液体培养基。邻苯二甲酸二丁酯标准品:分析纯,天津市富精细化工有限公司;乙酸乙酯(色谱纯)、葡萄糖(分析纯):天津市优谱化学试剂有限公司;甲醇、丙酮、硫酸镁:分析纯,重庆川江化学试剂厂;磷酸二氢钾:分析纯,重庆茂业化学试剂有限公司;维生素B1.2主要设备Agilent7890/5975C-GC/MSD气相色谱—质谱联用仪:美国安捷伦科技有限公司。1.3方法1.3.1标准曲线的绘制依据王鑫等1.3.2样品的制备1.3.2.水培养液制备通过打孔法将菌丝定量接种于250mL三角瓶50mL综合马铃薯液体培养基中,25℃、110r/min恒温摇床上分别培养15、30、45d,同时并作空白培养液对照。按培养时间依次取出,并抽滤菌丝,滤液(即培养液,取100mL)用无菌棕色广口瓶储存,于4℃冰箱中贮存备用。竹荪菌丝经蒸馏水重复洗3遍,抽滤,于30℃的干燥箱中烘干至恒重,研磨,分别获15、30、45d培养的竹荪菌丝干品0.97、1.13、1.04g。1.3.2.乙酸乙酯的提取分别准确称取15、30、45d竹荪菌丝干品粉末0.5g(精确到0.0001g)至20mL具塞磨口玻璃试管,加入5.0mL乙酸乙酯,振荡混匀,浸置30min,在60℃的超声条件下提取40min,收集提取液,再加入5.0mL乙酸乙酯重复提取2次,每次20min,合并提取液,室温下氮气吹干,乙酸乙酯定容至1.0mL,待GC-MS进行分析测定,外标法定量,然后进行样品含量计算。1.3.2.竹蚤及其同晶型干品制备取0、15、30、45d空白培养液与培养液,分别于80℃条件下旋转蒸发浓缩至近干,移至50mL具塞磨口锥形瓶中,按竹荪菌丝干品相同步骤处理(提取过程中用到分液漏斗,将乙酸乙酯提取液与培养液分离),其测定分析方法同上。1.3.3进样口温度与升温程序色谱柱:Agilent19091S-433HP-5MS(325℃:30m×0.25μm×0.25μm);进样口温度230℃;升温程序:初始柱温190℃,保持2min,以10℃/min升温至250℃,保持5min,后运行5min,升至260℃,共运行13min;载气(He,纯度≥99.999%),流速1mL/min;进样量:1.0μL;分流比10∶1。1.3.4提取溶剂为复合溶剂电子离源;电子能量70eV,离子源温度230℃,四级杆温度150℃,乙酸乙酯提取物溶剂延迟2.50min,质量扫描范围m/z50~500。2结果与分析2.1标准曲线及线性回归方程以DBP标准溶液浓度x为横坐标,平均响应值y为纵坐标绘制标准曲线(见图1),DBP标准线性回归方程为y=26021x-74798,R2.2不同培养时间培养液对dbp含量的测定经GC-MS对空白培养液中的DBP进行了5次平行分析测定。空白培养液中的DBP浓度为19.30μg/mL。对不同时间的培养液以及竹荪菌丝中的DBP分别进行5次平行分析测定。测定试验用外标法进行定量,其测定结果见表1与表2。不同培养时间培养液的DBP的浓度在17.71μg/mL~20.50μg/mL范围内,其中30d含量最高。培养液中DBP含量的波动变化受菌丝的生长影响。而在不同培养时间菌丝中的DBP的含量在28.86mg/kg~33.52mg/kg范围,其中生长30d的菌丝中的DBP含量最低。2.3加标回收率及其精密度以30d竹荪菌丝干粉样品减半量进行添加回收试验。按100%的供试品溶液浓度添加DBP标准溶液,其中添加浓度为10.87μg/mL。按照试验相同条件及其步骤,平行测定9次,外标法定量。计算回收率及其精密度(RSD),其测定结果如表3所示。样品加标回收率为95.4%~105.0%,其平均回收率为98.9%,RSD为3.4%。结果表明,该方法能够满足样品的测定要求。3)试验过程与试剂空白试验DBP属于PAEs中的一类重要化工原料,广泛用于农药、杀虫剂、化妆品、香料等的生产中。因此,试验过程中应尽量避免PAEs类化合物的污染。为了试验结果的准确度,试验前按试验提供的GC-MS分析条件,进行了试剂空白试验,后续试验中所测得的试验均为扣除空白值。试验结果表明:空白培养液、不同培养时间的培养液以及竹荪菌丝提取液中均含有DBP。3.1含量测定在空白培养液提取液中被检测到较高的DBP含量,浓度达19.30μg/mL。可能是培养基原料中的带入,以及试验过程中培养基透气封口膜和一次性过滤器的使用之故。3.2培养过程中dbp含量的变化由于空白培养液本身存在一定的DBP物质,所以培养液中也含有一定的DBP含量,浓度在17.71~20.50μg/mL范围,且与空白培养基的DBP浓度相比呈现降升降的趋势,说明在菌丝培养过程中,培养液中DBP含量受菌丝生长的影响。3.3通过释放dbp实现环境趋避作用竹荪菌丝中含有较高的DBP含量,含量在28.86mg/kg~33.52mg/kg范围,含量呈现升降升的趋势。表现为竹荪菌丝生长初期对环境中(培养基)的DBP具有一定的富集作用。随着竹荪菌丝生长的进行,本身也能够产生一定量的DBP,并通过释放到环境中(培养基)中,致使培养基的DBP含量升高,可能为实现环境的趋避作用。菌丝生长后期,通过自生产生和对培养基中DBP的富集,致使菌丝中DBP的浓度反弹升高,导致菌丝中的DBP浓度远大于培养液中的DBP浓度。可能是生长后期为实现趋避作用加强自生保护所致。综上所述,竹荪菌丝在培养