应用issr指纹图谱鉴定上海早梨3个主栽品种

应用issr指纹图谱鉴定上海早梨3个主栽品种

上饶早梨是蔷薇科的一种植物。主要品种包括6月份的雪和黄色相思。江西省上饶县主要分布在花厅市和田墩市等市。上饶早梨,成熟早,且表皮薄、果肉嫩、香甜可口,具有生津润肺、清热化痰、解热消暑之功效,老少皆宜(周爱贤和蒋群华,2014,现代农业科技,(23):126-127)。上饶早梨营养丰富,据测定,100g含8g苹果酸、8g葡萄糖、10g碳水化合物、1g蛋白质、0.1g脂肪、5mg钙、6mg磷。上饶早梨不但可以鲜食,还可作为中成药“雪梨膏”的绝佳原料。近年来,上饶早梨的种植业已经得到迅速的发展,上饶早梨的农业产业化龙头企业不断增加,上饶早梨生产基地达2.2万亩,产量达三万多吨。但由于上饶早梨是江西早熟梨的特优地方品种,分布范围较窄,道地性野生资源较少(辜青青等,2010,现代园艺,(9):14-15),因此,大力发展上饶早梨的产业,实现其规模化生产,就必须通过植物组织培养的手段,建立起一整套较为完善的离体快繁技术体系,培育大量的种苗,从而实现上饶早梨的快速推广种植。本课题组自2014年以来,在2014年度江西省高等学校科技落地计划产学研合作项目的大力支持下开展了上饶早梨三个主栽品种道地性野生资源的调查和收集,并对其进行了脱毒快繁的研究工作。本研究拟采用ISSR分子标记的方法,对上饶早梨3个主栽品种(“花厅六月雪”“花厅黄皮消”和“田墩六月雪”)的亲缘关系以及其不同继代次数(8~13代)试管苗的遗传变异进行探究,并构建上饶早梨3个主栽品种及其不同继代次数试管苗的分子指纹图谱,旨在为上饶早梨优质种苗的培育及其道地性主栽品种的鉴定提供参考。1结果与分析1.1引物的筛选及其扩增利用ISSR分子标记技术对上饶早梨3个主栽品种样本(包括种质圃种苗和其不同继代次数试管苗)20个样本(S1~S7为花厅六月雪;S8~S13为花厅黄皮消;S14~S20为田墩六月雪,下同)进行分析。引物CW32440没有扩增出条带,所以以后的试验就以9条引物(CW32437、CW32438、CW32447、CW32466、CW32467、CW32488、CW39119、CW39124和CW39-128)来进行ISSR试验(图1)。从9条引物,共获得47条清晰可辨条带,其中多态性条带24条,平均多态性比率为51.06%,平均每对引物扩增出4.7条带,其中2.4条具有多态性。其中,引物CW32438多态性最高,为100.00%,引物CW32466多态性最低,只有20.00%(表1)。上饶早梨3个主栽品种20个样本的观测等位基因数Na值在1.2000~1.7273之间,其均值是1.5106;上饶早梨3个主栽品种20个样本的有效等位基因数Ne值在1.0940~2.0000之间,其均值是1.3016;上饶早梨3个主栽品种20个样本的Nei基因多样度He值在0.0625~0.3783,其均值是0.1828;上饶早梨3个主栽品种20个样本的Shannon信息指数I值在0.0983~0.5607,平均值为0.2753(表1)。这个结果表明,上饶早梨3个主栽品种20个样本的遗传多样性水平较低。1.2不同主栽品种dna指纹图谱的构建根据9条引物的ISSR-PCR扩增图,用quantityone软件绘制了其电泳模式图(图2),通过分析,上饶早梨3个主栽品种20份样本中引物CW32447、CW32467、CW32488、CW39119和CW39128的扩增条数均无差异。为此,我们筛选出CW32447、CW32467、CW32488、CW39119和CW39128共5条核心引物,并对5条引物的扩增图谱进行编码组合,构建了上饶早梨3个主栽品种的DNA分子指纹图谱(表2)。上饶早梨“花厅六月雪”和“花厅黄皮消”的DNA分子指纹图谱是相同的,而上饶早梨“田墩六月雪”的DNA分子指纹图谱与“花厅六月雪”和“花厅黄皮消”相比,差异较大,上饶早梨3个主栽品种的分布具有明显的地域特征(表2)。因此,我们可以根据DNA分子指纹图谱可有效鉴定上饶早梨“田墩六月雪、“花厅六月雪”和“花厅黄皮消”的归属地,从而能真正对上饶早梨主栽品种的道地性有了一个明确的理解。1.3不同主栽品种聚类分析利用9对引物在上饶早梨3个主栽品种20个样品获得的47条扩增片段,在NTSYS软件中计算样品间的遗传相似系数(GS值),得到供试材料遗传相似系数矩阵(表4)。遗传相似系数越大,表明亲缘关系越近,遗传相似系数越小,表明亲缘关系越远。上饶早梨3个主栽品种20个样品的GS值范围为:0.6173~1.0000,平均值为0.8066,变幅为0.3827。其中,样本S6(即“花厅六月雪”)与样本S8(即“花厅黄皮消”)的GS值最高,达1.000。样本S11(即“花厅黄皮消”)与样本S16(即“田墩六月雪”)的GS值最低,达0.5319。样本S3(即“花厅六月雪”)和S4(即“花厅六月雪”)与样本S16(即“田墩六月雪”)的GS值也很低,为0.5532(表4)。根据遗传相似系数矩阵,利用UPGMA法对上饶早梨3个主栽品种20个样品进行聚类分析,建立聚类树状图(图3)。在GS值为0.8177处,上饶早梨3个主栽品种20个样品可分为2个类群,类群Ⅰ主要包括样本S1~S7(即“花厅六月雪”)和S8~S13(即“花厅黄皮消”),样本S14~S20(即“田墩六月雪”)被聚为类群Ⅱ(图3)。这个结果与上饶早梨3个主栽品种的DNA分子指纹图谱相一致。1.4再生苗的扩增上饶早梨“花厅六月雪”对照组(样本S1)中9条引物CW32437、CW32438、CW32447、CW32466、C-W32467、CW32488、CW39119、CW39124和CW391-28的扩增条带数为32条,继代8~13次试管苗(依次是样本S2~S7)中9条引物CW32437、CW32438、CW32447、CW32466、CW32467、CW32488、CW391-19、CW39124和CW39128的扩增条带数分别为34、33、35、34、37和35,变异率依次为6.25%、3.13%、9.38%、6.25%、15.63%和9.38%,平均变异率为8.34%(图2)。上饶早梨“花厅黄皮消”对照组(样本S8)中9条引物CW32437、CW32438、CW32447、CW32466、CW32467、CW32488、CW39119、CW39124和CW39-128的扩增条带数为37条,继代8~12次试管苗(依次是样本S9~S13)中9条引物CW32437、CW32438、CW32447、CW32466、CW32467、CW32488、CW391-19、CW39124和CW39128的扩增条带数分别为34、33、34、33和34,变异率依次为8.11%、10.81%、8.11%、10.81%和8.11%,平均变异率为9.19%。上饶早梨“田墩六月雪”对照组(样本S14)中9条引物CW32437、CW32438、CW32447、CW32466、CW32467、CW3248-8、CW39119、CW39124和CW39128的扩增条带数为36条,继代8~13次试管苗(依次是样本S15~S20)中9条引物CW32437、CW32438、CW32447、CW32-466、CW32467、CW32488、CW39119、CW39124和C-W39128的扩增条带数分别为37、36、37、36、36和34,变异率依次为2.78%、0%、2.78%、0%、0%和5.56%,平均变异率为1.85%。因此,上饶早梨3个主栽品种分别继代8~13次,均会造成试管苗一定程度的变异,其中,“花厅黄皮消”连续继代造成变异的可能性越大,而“田墩六月雪”连续继代造成变异的可能性越小。样本S1~S7的平均值为0.9438,样本S8~S13的平均值为0.9443,样本S14~S20的平均值为0.9529,均高于平均值0.8066(表3)。上饶早梨3个主栽品种继代8~13次的试管苗的引物CW32447、CW32467、CW32488、CW39119和CW39128扩增位点均十分稳定,没有出现特异性条带(图2)。这表明在DNA分子标记层面,上饶早梨3个主栽品种虽然存在一定变异,但这种遗传差异无显著性,说明通过带芽茎段对上饶早梨3个主栽品种进行离体快繁可以保证其遗传稳定性。2不同主栽品种分子标记的应用及聚类分析ISSR(inter-simplesequencerepeat),即简单重复序列间隔区,是Zietkiewicz等(1994)提出,并是以SSR标记为基础的一种新DNA标记方法。这种方法操作比较容易。而且实验结果十分可靠,具有较稳定的实验重复性(魏青永等,2016)。传统上,梨的品种鉴定主要是依靠形态学的调查来进行的。而梨品种的正确甄别是梨种苗培育和种质保存最基本的前提。ISSR标记技术的应用为梨品种的快速鉴定提供了一种比较有效的方法。目前,已有许多ISSR分子标记应用梨遗传多样性及品种鉴定方面的报道。赵国芳(2003)利用ISSR构建了梨属52个栽培品种的指纹图谱,指出新疆梨应该是白梨系统与西洋梨系统形成的种间杂种。朱迎弟(2007)对安徽砀山酥梨自然保护区梨种质资源26个品种进行了ISSR研究,并将26个品种分为8类。尤桂春(2009)对福建省梨种质资源56个栽培品种进行了ISSR分析,揭示了56个梨品种之间的亲缘关系。李洪果等(2009)建立了13个砂梨品种的ISSR分子识别卡。单江华等(2010)用ISSR分子标记可将48份新疆梨种质资源分为3类。宋燕春(2013)构建并优化了南亚热带地区梨种质资源的ISSR-PCR体系,发现38份梨品种的遗传聚类与其低温需冷的积累量具有相关性。张起和安华明(2015)通过ISSR分析,发现贵州59份砂梨种质资源具有丰富的遗传多样性和较高遗传分化,并指出较高遗传分化的影响因素主要有地理隔离和人为干预等。在本研究中,应用筛选出的10条引物对上饶早梨3个主栽品种20份样本进行ISSR分子标记分析。UPGMA法聚类分析结果表明,在GS值为0.8177处,可将上饶早梨主栽品种分为两类,“花厅六月雪”和“花厅黄皮消”为第Ⅰ类,“田墩六月雪”为第Ⅱ类。同时,依据其ISSR扩增模式图进行编码组合,构建了上饶早梨3个主栽品种的DNA分子指纹图谱。利用这些指纹图谱的差异,我们可快速鉴定出上饶早梨主栽品种的归属地,从而有助于我们对上饶早梨主栽品种的道地性有了一个明确的理解。对梨品种完成分子标记鉴定后,如需扩大梨的种植规模,就要利用植物组织培养技术对其进行离体快繁,以获得足够数量的梨优良品种的种苗。但在植物离体快繁的过程中,植物经过多次继代后,容易发生无性系变异。因此,有必要通过DNA分子标记对继代多次的试管苗进行遗传稳定性的鉴定。李毅丹等(2009)、覃子海等(2013)和杨世鹏等(2015)通过对日本石楠、桉树和菊芋继代苗遗传稳定性的AFLP、SSR和ISSR分析,发现在多次继代后,日本石楠、桉树和菊芋的继代苗无遗传变异。但高素芳等(2014,中药材,37(5):744-746)利用ISSR-PCR分子标记检测当归试管苗的遗传稳定性,发现其DNA条带的变异率仅为0.662%,保证了较高的遗传稳定性。利用RAPD分析滇黄芩不同继代次数试管苗,发现39条随机引物中只有1条引物的带型发生变化。陈泽雄等(2013)在对灰毡毛忍冬遗传稳定性的SRAP分析中,发现继代1年的试管苗无变异,继代2年或3年的试管苗分别有2株和4株发生变异,认为在离体快繁中控制一定的继代周期可保证其遗传稳定性。柴素芬等(2010)发现梅菜试管苗继代4次后,部分引物带型发生变化,但变化不显著,仍具有较高的遗传稳定性,认为梅菜试管苗继代4次之内不会影响其稳定遗传。本试验结果与其类似,在本试验中,通过带芽茎段对上饶早梨3个主栽品种连续继代8~13次,均开始出现一定程度的变异,但这种变异无显著性,说明上饶早梨3个主栽品种离体快繁在继代8次或8次以上会出现遗传变异,但仍可保证其遗传稳定性。3材料和方法3.1接种苗的选择上饶早梨3个主栽品种“花厅六月雪”种质圃种苗(编号S1,对照组)、“花厅黄皮消”种质圃种苗(编号S8,对照组)、“田墩六月雪”种质圃种苗(编号S14,对照组)、上饶早梨“花厅六月雪”继代9~13次的试管苗(每次继代时间为3个月,继代9~13次试管苗依次分别编号S2~S7)、上饶早梨“花厅黄皮消”继代9~12次的试管苗(每次继代时间为3个月,继代9~13次试管苗依次分别编号S9~S13)和上饶早梨“田墩六月雪”继代9~13次的试管苗(每次继代时间为3个月,继代9~13次试管苗依次分别编号S15~S20)。3.2提取dna的方法采用改良CTAB方法提取方法提取DNA。3.3dntps模板ISSR-PCR扩增体系(25μL)为:DNA模板约50