肠杆菌科细菌金属-内酰胺酶的基因型及流行情况

肠杆菌科细菌金属-内酰胺酶的基因型及流行情况

随着碳绿霉素在临床上的广泛应用，抗碳绿霉素的肠球菌（cre）逐渐增加。产碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌耐碳青霉烯类抗生素的重要机制。碳青霉烯酶是指能够明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的一类β-内酰胺酶,包括Ambler分子结构分类的A、B、D三类酶,其中A、D类为丝氨酸酶,属于Bush分群中的第2f和2d亚组;金属β-内酰胺酶属于AmblerB类(Bush3组),其催化活性依赖Zn1材料和方法1.1材料表面1.1.1菌株的筛选和生化鉴定3297株肠杆菌科细菌均分离自重庆医科大学附属第一医院2007年1月—2011年12月住院确诊感染患者的送检标本(痰液、血液、尿液、分泌物、胆汁等),剔除同一患者分离的重复菌株;包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、黏质沙雷菌等。常规分离菌株,采用VITEK2Compact全自动细菌鉴定仪进行生化鉴定并保存。药敏试验质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603,均为本实验室保存菌种。对叠氮钠耐药的大肠埃希菌J53Az1.1.2试剂与质粒提取亚胺培南、美罗培南药物纸片购自英国Oxoid公司;多种抗菌药物标准品为中国药品生物制品鉴定所产品;EtestMBL确认纸条购自法国生物梅里埃公司;细菌DNA提取试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司;聚合酶链反应(PCR)试剂购自宝生物工程有限公司;OMEGA质粒提取试剂盒购自美国OMEGA生物技术公司;LambdaDNA-PFGEMarkers为美国BIO-RAD公司产品;凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司产品),DYY-Ⅲ8A稳压稳流定时电泳仪(北京六一仪器厂),TermoCycleS1000PCR扩增仪(美国BIO-RAD公司),脉冲场电泳仪(BIORADCHEF-DRⅡ型)。1.2方法1.2.1菌株对多种抗菌药物的最低抑菌浓度采用美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的纸片扩散法(Kirby-Bauer)和琼脂稀释法测定菌株对多种抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)值;结果根据CLSI2010年版标准1.2.2产碳酪氨酸酶表型测定改良Hodge法1.2.3pcr扩增条件参考文献[3]合成6对金属β-内酰胺酶基因引物,见表1。采用细菌DNA提取试剂盒提取DNA模板,PCR反应体系为50μL,其中TaKaraPremixTaq酶25μL,DNA4μL,上下游引物各1μL,灭菌超纯水19μL。扩增条件为:94℃预变性10min;94℃变性60s,60℃退火30s,72℃延伸30s,共35个循环;72℃延伸10min。取5μLPCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果,用凝胶成像系统照相保存。目的基因PCR扩增产物送上海英潍捷基有限公司测序。DNA序列用NCBI网站()的BLAST比对确定基因型。1.2.4在联合实验中，测定了质粒的转移和pcr质量粒的pcr试验产IMP-8金属酶的肺炎克雷伯菌作为供体菌,对叠氮钠耐药的大肠埃希菌J53Az1.2.5脉冲场凝胶电泳挑取新鲜单个菌落接种至5mLLB肉汤中,37℃振荡过夜。菌悬液离心沉淀后与1.5mLPIV缓冲液混匀,使细菌浊度为4MCF。取600μL菌液加入已融化的等体积的1.6%低熔点胶充分混匀后倒入模具制成凝胶块。将凝胶块投入EC-lisis缓冲液中37℃轻振荡5h后,换成ESP缓冲液50℃轻振荡水浴过夜。TE洗涤胶块3次,切下2~3mm大小胶块,浸入酶切体系(含XbaⅠ酶1500U4μL)中,37℃水浴酶切过夜。电泳参数为6V/cm,脉冲时间4~40s,14℃,120°夹角,电泳时间20h。电泳结束后EB染色,凝胶成像系统观察并拍照。PFGE结果判读按Tenover等2结果2.1菌株组成和菌株3297株肠杆菌科细菌中,对碳青霉烯类抗生素耐药的菌株共41株,其中肺炎克雷伯菌14株,阴沟肠杆菌12株,大肠埃希菌10株,产酸克雷伯菌3株,奇异变形杆菌和黏质沙雷菌各1株。肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率逐年上升,但大部分大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌目前仍对碳青霉烯类抗生素敏感,见表2。2.2产碳青霉烯酶表型阳性菌株41株耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科细菌中,改良Hodge试验阳性的菌株为产碳青霉烯酶表型阳性株,共14株,其中肺炎克雷伯菌7株,阴沟肠杆菌5株,大肠埃希菌2株。见图1。14株改良Hodge试验阳性的菌株中,3株IP/IPI检测阳性,见图2。2.3碳青霉酶阳性真菌对各种抗菌药物的抗性采用CLSI推荐的琼脂平板稀释法检测14株碳青霉烯酶表型阳性菌株对不同抗菌药物的耐药性,药敏试验结果根据美国CLSI2010年版2.4pcr-内酰胺酶基因的结果14株碳青霉烯酶表型阳性菌株PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳,未见bla2.5联合试验与优质粒pcr试验结果3株携带bla2.6pfga分类结果3株携带bla2.7产一次bla3植物携带bla3青霉烯类药物的耐药机制碳青霉烯类抗生素是治疗革兰阴性杆菌感染最有效的抗菌药物,但随着近年来其在临床的广泛使用,该院2007—2011年肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性逐年上升,其中以肺炎克雷伯菌为主。碳青霉烯酶是指能够明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的一类β-内酰胺酶,包括Ambler分子结构分类的A、B、D三类酶,其中B类为金属酶,属于Bush分群中的第3组,能水解青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素,不能被β-内酰胺酶抑制剂他唑巴坦、克拉维酸抑制,对氨曲南无水解活性,可被EDTA等金属螯合剂抑制,其耐药谱较A、D类酶范围广,且基因型最多,世界分布范围较A、B类酶更广自1991年日本学者在铜绿假单胞菌中发现第1株质粒介导的金属酶IMP-1后,现在已报