芍药苷-6-o-苯磺酸酯在caco-2细胞模型中吸收和转运机制研究

芍药苷-6-o'-苯磺酸酯在caco-2细胞模型中吸收和转运机制研究

白芍总物质（tcg）提取于牡丹干燥的根系。临床上，tcg治疗风湿性关节（ra）的治疗效果明显，但疗效缓慢。1材料和方法1.1材料表面1.1.1色谱级及其应用CP-25:白色粉末状,自制,纯度>98%;DMEM培养基和胰蛋白酶购自美国Gibco公司;甲醇、乙腈为色谱级,购于Merck公司;Transwell12孔板购自Corning公司;MTT购自白鲨生物科技有限公司;胎牛血清购自美国Gibco公司;GF120918购自美国Sigma公司,纯度>95%;MK571购自美国Sigma公司,纯度>95%;KO143购自美国Sigma公司,纯度>98%。1.1.2实验中的细胞植物Caco-2细胞购于ATCC(A-mericanTypeCultureCollection)1.1.3高效液相色谱仪SW-CJ系列洁净工作台购自苏州净化设备工程有限公司;Agilent1200高效液相色谱仪购自美国安捷伦公司;AA-200DS电子分析天平购自Denver仪器公司;CO1.2实验方法1.2.125-2细胞模型的测定方法是建立cp-251.2.1.流动相、柱温度和检测波长Agilent1200高效液相色谱仪色谱仪;AglientTC-C18(5mm×250mm);流动相:甲醇-水(53∶47);柱温:30℃;流速:0.8ml/min;进样量:20μl;检测波长:230nm。在该条件下CP-25的色谱峰与相邻峰基线分离度较好,峰形对称。1.2.1.标准曲线的制备将CP-25储备液溶液用HBSS液分别稀释成1、2、5、10、20、40、80μg/ml的质量浓度标准溶液,取上述标准溶液涡旋混合1min,放置15min后,取上清液0.2ml进样测定,记录峰面积。以峰面积为Y,质量浓度为X(μg/ml)作线性回归,计算相关回归方程。1.2.1.不同浓度涡流带水浴槽中注浆峰面积的测定精密称取CP-25标准品,用HBSS液溶解并定容至10μg/ml,置于37℃恒温水浴槽中保温,分别于0、0.5、1、1.5、2、3h取样涡旋混合1min,放置15min后,取上清液0.2ml按照1.2.1.1项下进行操作,记录相应峰面积。1.2.1.样品制备方法取线性范围内低(5μg/ml)、中(10μg/ml)、高(20μg/ml)3个浓度样品,按1.2.1.1项下操作,每个浓度样品制备5份。同一样品1d内测定5次的结果为日内精密度,连续5d测定同一样品的结果为日间精密度。1.2.1.加标回收率的测定取CP-25线性范围内低(5μg/ml)、中(10μg/ml)、高(20μg/ml)3个浓度的样品,按1.2.1.1项下操作并记录峰面积。将CP-25峰面积代入标准曲线中,即得CP-25的实际加入的浓度,以测定质量浓度与加入质量浓度之比计算回收率即得CP-25低、中、高3个浓度的回收率。另用流动相制备相同浓度的CP-25样品溶液,直接进样并记录其峰面积,两峰面积之比即为相对回收率。1.2.2caco-2细胞模型的构建1.2.2.dmem培养基Caco-2细胞在含10%FBS、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺和1%的链青霉素的DMEM培养基中于37℃、相对湿度95%、5%CO1.2.2.2c-2细胞层的构建将Caco-2细胞以密度为1×101.2.2.细胞跨膜电阻值的测定细胞在接种后的4、8、12、16、20、22d分别用MillicellERS-2细胞电阻仪测定细胞跨膜电阻值,按照下列公式计算跨膜电阻值(transepithelialelectricalresistance,TEER):TEER=(R1.2.3cp-25对caco-2细胞模型中的吸收和转移机制的研究1.2.3.1tt法检测cp-25对caco-2单调层的毒性胰酶消化对数生长期Caco-2细胞制成单细胞悬液,以每孔5×101.2.3.将CP-25溶解于HBSS培养基中,制备不同浓度的CP-25,分别为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μg/ml。细胞在不同浓度的CP-25HBSS培养基中孵育2h,2h后分别在AP侧和BL侧吸取0.2ml溶液按照1.2.1.1项下操作,记录其峰面积。1.2.3.设立含药细胞将浓度为5、10、20μg/ml的CP-25以0.5ml体积分别加入AP侧,并将1.5mlHBSS培养基加入到BL侧。随后将含药细胞放置在4℃下培养2h。2h后,从每个样品的BL侧取出0.2ml溶液按照1.2.1.1项下操作,记录其峰面积。1.2.3.gf-4009、ml-971和ko133将CP-25用甲醇溶解并用HBSS培养基稀释,其含药稀释液用于溶解GF-120918、MK-571和KO143。P-gp拮抗剂GF120918(100μmol/L)1.3表中的渗透系数pP其中,ΔQ/Δt为化合物单位时间内的透过速率,A为细胞表面积,即为本模型中支持膜的面积(1.12cm1.4表中的渗透比计算公式pdrPDR是受试物从BL面到AP面和AP面搭配BL面之比,其大小反映了受试物吸收机制。PDR由下式计算:其中,P1.5数据分析和统计学处理所有实验数据的测定值皆以ue0af±s表示。数据分析采用SPSS18.0软件,组间差异比较采用单因素方差分析和t检验,P<0.05表示两组数据差异有统计学意义。2结果2.1hplc图像的特异性2.2溶液干扰及模型内溶液干扰HPLC测定Caco-2细胞模型HBSS液中的CP-25,出峰时间11.6min,出峰时间适宜,无明显Caco-2模型内溶液干扰。CP-25标准曲线为Y=24.403X-23.678(r2.3caco-2细胞的ter值的测量Caco-2细胞接种Transwell小室后逐渐形成细胞单层,TEER值逐渐升高,22d时达到(580±35)℃·cm2.4cp-25在不同浓度cp-25下的毒性CP-25对Caco-2单细胞层的毒性结果如图3所示,CP-25在0.2~20μg/ml范围48h内未见毒性。因此,本研究使用此范围内的浓度进行后续转运实验。2.5不同浓度对cp-25的转移的影响结果如表1所示,CP-25的P2.6不同温度对cp-25的旋转的影响结果如表2所示,与37℃时P2.7对cp-25的pP-gp抑制剂GF120918(100μmol/L)、MRP2抑制剂MK571(50μmol/L)和BCRP抑制剂KO143(10μmol/L)对CP-25的P3cp-25对外排转运蛋白的活性良好的口服吸收是新药筛选的先决条件,药物溶解度和胃肠道的渗透性是影响口服吸收的主要因素。一般来说,药物溶解度和渗透性与其物理化学性质如亲脂性、分子大小、氢键强度和电离强度有关。然而,预测人的口服吸收却相对复杂,特别是在早期药物开发阶段。一些体外实验方法广泛用于新药的筛选和药物相关吸收机制的研究,Caco-2细胞体外分化成类似人的肠上皮细胞时可表达肠道特有的水解酶载体介导转运对温度十分敏感,载体是存在于细胞膜上的转运蛋白,只有在合适的温度条件下才具有生物活性。本实验在4℃条件下时,CP-25和Pae(5、10、20μg/ml)的PP-gp、MRP2和BCRP是ATP结合盒转运蛋白家族中研究最多的外排转运蛋白综上所述