常用中药的生物鉴定

常用中药的生物鉴定第1页，课件共46页，创作于2023年2月常用中药的生物鉴定方法免疫鉴定法电泳鉴定法生物效价鉴定法单纯指标鉴定法细胞生物学鉴定法DNA遗传标记鉴定法mRNA差异显示鉴定法第2页，课件共46页，创作于2023年2月聚合酶链式反应

(PolymeraseChainReaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。第3页，课件共46页，创作于2023年2月少量DNA样品快速扩增amplify技术。

(inventedbyKaryMullis,wonaNobelPrizeinChemistryin1993)第4页，课件共46页，创作于2023年2月原理第5页，课件共46页，创作于2023年2月

PCR要件模板Template

引物

Primers:

SmallpiecesofDNA. Madeupof15to30bases.

BindstheDNAataspecificregion. forwardandreverse正向和逆向酶Enzyme:

TaqDNApolymerase

PCR核酸Nucleotides:

Substrate,fourdeoxyribonucleotides(A,C,G,T) dNTP第6页，课件共46页，创作于2023年2月MDistH2O 117ul10Xbuffer 15uldNTP 12ulPrimer1 3ulPrimer2 3ulTaqpolymerase 0.75ul200ultubePipette上下混合第7页，课件共46页，创作于2023年2月取出15ul剩下的加入3ulTemplateDNA用pipette上下混合分装入tube15ul/支标上1…….51234554°C56586062RunPCRTcTc55°C不加模板的对照组M

第8页，课件共46页，创作于2023年2月加入1ul模板DNA不加引物但有模板的对照Pc第9页，课件共46页，创作于2023年2月15ulMTC3ultemplate(T)PipettemixTC15ul/tubepcPC123451ultemplateT第10页，课件共46页，创作于2023年2月TCPC1234554555657586062oCRNU第11页，课件共46页，创作于2023年2月ProgramDenature95°C 5minDenaturation变性：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA，一般加热至90－95℃,30secAnnealing褪火：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链，55－70℃，固称其为褪火。mostimportantfactorinthePCR,45secExtension延伸：在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链,温度为70－75ºC,1.5minFinalextension72°C,5min第12页，课件共46页，创作于2023年2月第13页，课件共46页，创作于2023年2月第14页，课件共46页，创作于2023年2月第15页，课件共46页，创作于2023年2月第16页，课件共46页，创作于2023年2月第17页，课件共46页，创作于2023年2月第18页，课件共46页，创作于2023年2月第19页，课件共46页，创作于2023年2月第20页，课件共46页，创作于2023年2月第21页，课件共46页，创作于2023年2月第22页，课件共46页，创作于2023年2月第23页，课件共46页，创作于2023年2月第24页，课件共46页，创作于2023年2月2x106第25页，课件共46页，创作于2023年2月优点:needverysmallamountofsample缺点: amplifiedproductmaybecontaminated withothersamplesnotrelatedtothe one第26页，课件共46页，创作于2023年2月FactorsaffecttoPCRMg+2concentration,

Mg+2

specificity

0.1~5mmol/LMg+2预实验Primer(引物)specificityDegenerateprimer---tofindthetargetgeneinthecloselyrelatedspeciesspecificity,nonspecificproducts第27页，课件共46页，创作于2023年2月AnnealingTemperature Toohigh noPCRproduct Toolow muchnonspecificproduct gradientTempPCRmachine findthesuitableTempTaqpolymerasequalityTemplate(模板)DNAquality第28页，课件共46页，创作于2023年2月PCR产物鉴定Agarosegelelectrophoresistocheckproduct1.5%AgaroseinTAEbuffer(17ml)boilPourintothetray(assembledgelapparatus)第29页，课件共46页，创作于2023年2月第30页，课件共46页，创作于2023年2月AfterPCRamplificationAgarosegelelectrophoresistocheckproduct1.5%agarosein17mlTAE(4mmthick)5ulproductadd1ul6Xloadingdyemix1Kbmarker2.5ul100Vrun25-30minEBstain10min(EB致癌物,戴手套),photograph第31页，课件共46页，创作于2023年2月1.51.00.50.2Kb10gammaprimerMismatch3base10gammaprimercompletematch第32页，课件共46页，创作于2023年2月PCR的应用1.detectiongeneticallymodificationorganism (GMO)检测转基因生物，找出特异的基因或片段 find

specificgeneorfragment(promoter)

2.unculturedmicroorganism3.pathogenidentification4.detectioninsertionsequence(cloning)第33页，课件共46页，创作于2023年2月提取模板反应体系配置PCR扩增电泳引物设计第34页，课件共46页，创作于2023年2月乌梢蛇为《中国药典》(2010版)一部收载的一种常用中药，来源于游蛇科动物乌梢蛇[Zaocysdhumnades(Cantor)]的干燥体。有祛风、通络、止痉之功效。用于风湿顽痹、麻木拘挛、半身不遂、抽搐痉挛、瘰疠恶疮。商品流通中多以红点锦蛇、黑眉锦蛇、玉斑锦蛇、王锦蛇、灰鼠蛇等来混作正品药材进行销售，这些品种多数与乌梢蛇同科不同属，因其来源相近，造成鉴定困难。此外，药材在加工处理时剖去内脏后，要进行干燥熏黑处理，皮上的花纹特征、颜色几近消失，难以辨认，而且其大小、形态特征与乌梢蛇相近，这是造成其性状鉴别困难的另一重要原因。鉴于乌梢蛇作为中药的临床功效确切，但商品来源复杂、药材性状鉴别困难的现状，为满足目前市场常见混伪品的鉴别要求，寻找经济实用、准确便捷、稳定性高的方法，应用高特异性PCR方法对乌梢蛇药材及其混淆品的原动物和炮制品进行鉴别。第35页，课件共46页，创作于2023年2月高特异性PCR方法鉴别乌梢蛇及其混淆品第36页，课件共46页，创作于2023年2月功效：祛风、通络、止痉。市售混淆品：红点锦蛇、黑眉锦蛇、玉斑锦蛇、王锦蛇、灰鼠蛇等第37页，课件共46页，创作于2023年2月乌梢蛇高特异性

PCR鉴别引物的设计从GenBank下载正品原动物乌梢蛇及混伪品线粒体12SrRNA基因序列经DNAMAN软件对位排列分析正、混品间DNA序列差异，设计出一对能特异性扩增乌梢蛇12SrRNA基因片段的特异性鉴别引物HWL-1和HWH-1

（上海生工生物合成公司）第38页，课件共46页，创作于2023年2月模板DNA的提取

基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

第39页，课件共46页，创作于2023年2月特异性PCR鉴别反应体系：

Tris-HCl10mmol/L

氯化钾50mmol/LMg2+1.5mmol/LdNTP0.15μmol/LTaq1U(40ml)

引物0.15μmol/L

模板DNA50ng第40页，课件共46页，创作于2023年2月步骤预变性95°C 4min

变性95°C40sec褪火65°C1min延伸72°C30sec延伸72°C5min设置无DNA模板的阴性对照通用引物构成的阳性对照25cys第41页，课件共46页，创作于2023年2月琼脂糖凝胶电泳取5μl反应液经1.8%琼脂糖凝胶电泳EB染色紫外凝胶分析检测成像第42页，课件共46页，创作于2023年2月结