咔唑法测定中华鲟软骨中硫酸软骨素的含量

咔唑法测定中华鲟软骨中硫酸软骨素的含量周叶;赵婷;冯伟伟;李芸子;但招陵;刘治华;仰榴青【摘要】[Objective]TheaimwastodevelopaspectrophotometrymethodforthedeterminationofchondroitinsulfatefromChinesesturgeoncartilage.[Method]ChondroitinsulfatewasextractedfromChinesesturgeoncartilagebvthedilutealkali-enzymehydrolysismethod.ThecontentofchondroitinsulfatefromChinesesturgeoncartilagewasdeterminedbythecarbazolemethodandD-glucuronicacidwasusedasreferencestandard.Acolorreactionwasmadewithcarbazoleusingborax-sulfuricacidasmedium.Theabsorbancewasdeterminedat530nmandthecontentofD-glucuronicacidwascalculatedbyusingthestandardcurve,andthenconvertedintothecontentofchondroitinsulfate.Thedistilledwaterwastakenastheblankcontrol.[Result]Thecalibrationcurvewaslinearintherangeof10-50pg/mlforD-glucuronicacidandtheregressionequiationwasY=0.015X-0.037,r=0.9997.Theaveragerecoveriesforthreedifferentconcentrationswere100.87%,100.73%and101.29%(n=5),andtherelativestandarddeviationswere2.74%,2.56%and2.22%,respectively.[Conclusion]Themethodwasfastandhadgoodreproducibility.ItcanbeusedtodeterminethecontentofchondroitinsulfatefromChinesesturgeoncartilage.%[目的]建立分光光度法测定中华鲟软骨中硫酸软骨素含量的方法、[方法]采用碱提-酶解法提取中华鲟软骨中硫酸软骨素，采用咔唑法，以D-萄萄糖醛酸为标准品，在硼砂-浓硫酸介质中经咔唑显色后,以蒸馏水为空白,于波长530nm处分别测定对照品溶液和供试品溶液的吸光度，按标准曲线计算葡萄糖醛酸含量,进而转换为硫酸软骨素含量.［结果］D-葡萄糖醛酸在10~50pg/ml范围内线性关系良好，回归方程为Y=0.015X-0.037(r=0.9997),3个不同浓度的加样回收率分别为100.87%、100.73%和101.29%(n=5),RSD值分别为2.74%、2.56%和2.22%.［结论］该方法快速，重现性好,可用作中华鲟软骨中硫酸软骨素含量的测定.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷)，期】2011(039)019【总页数】2页(P11597-11598)【关键词】咔唑法;硫酸软骨素；D-萄糖醛酸;中华鲟软骨;含量测定【作者】周叶;赵婷;冯伟伟;李芸子;但招陵;刘治华;仰榴青【作者单位】江苏大学药学院，江苏，镇江,212013;江苏大学药学院，江苏，镇江,212013;江苏大学药学院，江苏，镇江,212013;江苏大学药学院，江苏，镇江,212013;江苏大学药学院，江苏，镇江,212013;江苏大学药学院，江苏，镇江,212013;江苏大学药学院,江苏,镇江,212013【正文语种】中文【中图分类】R282.74;R927.2;TS254.2中华鲟(Chinesesturgeon)，隶属鲟形目、鲟科、鲟属，是我国特有的3种鲟之一，为国家一级保护动物，具有水中〃活化石”之称。中华鲟不仅具有很好的营养价值，而且也具有独特的医药和保健价值，硫酸软骨素(Chondroitinsulfate,CS)即为其中最重要的物质之一。近年来，研究表明硫酸软骨素具有抗氧化、免疫调节、降血脂、抗凝血和软骨保护等多种生物活性［1］，有重要的研究和应用价值。CS测定方法有许多种，但其测定原理均是基于组成的糖单位（D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖）、硫酸基以及酸性粘多糖等大分子性质［2-3］,其中咔唑法测定硫酸软骨素已应用于鲨鱼及猪骨中［4-5］。但目前关于咔唑法用于中华鲟软骨中CS含量测定还未见报道。笔者采用咔唑法，以D-葡萄糖醛酸为标准品，对中华鲟软骨中葡萄糖醛酸的测定进行方法学考察，再计算硫酸软骨素含量，为中华鲟软骨中硫酸软骨素的提取工艺研究提供简便、快速的测定方法。1材料与方法1.1材料1.1.1试剂。D-葡萄糖醛酸、咔唑，四硼酸钠，购自国药集团化学试剂有限公司;其他试剂均为分析纯。1.1.2仪器。UV-7502PC可见分光光度计，购自上海茂欣仪器有限公司;Sigma1-13高速台式离心机，购自SIGMA公司;FD-1-50冷冻干燥机，购自北京博医康实验仪器有限公司。1.2方法1.2.1中华鲟软骨硫酸软骨素的制备。称取已脱脂的中华鲟软骨粉末适量，按一定的料液比，在一定浓度的NaOH溶液中于40°C恒温提取一定时间后，冷却，离心,得到软骨碱提液;碱提液调节pH至2~3,加入胃蛋白酶在37C进行酶解4h后，将温度调至85C灭酶20min，离心后将上清液减压浓缩，加95%乙醇，使其终浓度为80%进行沉淀后，所得沉淀经离心、冷冻干燥后即得硫酸软骨素粗品。得到的3批粗品编号分别为100411、100412和100413。1.2.2溶液的配制。①D-葡萄糖醛酸标准溶液。准确称取0.0100g经105C干燥至恒重的D-葡萄糖醛酸标准品于100ml容量瓶中，水溶解定容。②供试品溶液。准确称取硫酸软骨素样品0.0200g于100ml容量瓶中，水溶解定容，待测。③咔唑试剂。准确称取0.1250g咔唑于100ml棕色容量瓶中，无水乙醇溶解定容，冰箱保存。④硼砂-浓硫酸试剂。称取4.7671g四硼酸钠，置于500ml棕色容量瓶中，用浓硫酸溶解并定容，冰箱保存。1.2.3标准曲线的绘制。分别准确量取D-葡萄糖醛酸标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml置于10ml容量瓶中，加蒸馏水定容，得到一系列浓度的D-葡萄糖醛酸标准溶液。将装有5.0ml硼砂-硫酸试剂的试管，于冰浴条件下分别加入不同浓度的D-葡萄糖醛酸标准溶液各1.0ml，于沸水浴中加热10min，取出迅速冷却至室温。向水解液中加入咔唑试剂0.2ml，摇匀后置于沸水浴中加热15min，取出冷却至室温。以蒸馏水为空白，在530nm波长处分别测定吸光度（A）。以吸光度为纵坐标，D-葡萄糖醛酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。1.2.4精密度试验。分别量取标准溶液1.0、3.0和5.0ml置于10ml容量瓶中，蒸馏水定容，配成为10、30和50pg/ml的标准溶液。量取1.0ml标准溶液按照“1.2.3”中方法测定其吸光度，重复5次。1.2.5稳定性试验。取经显色后的硫酸软骨素样品溶液，在室温下放置1h,分别在10、20、30、40、50、60min测定其吸光度值，观察显色后溶液是否稳定。1.2.6重现性试验。取同一批样品（批号100411）5份，按供试品溶液制备后，按照“1.2.3”中方法测定样品的吸光度。1.2.7加样回收率试验。采用加样回收率法，准确量取供试品溶液0.5ml,分别加入浓度为10、30和50pg/ml标准品溶液0.5ml,重复5次，按“1.2.3”方法测定吸光度，计算其回收率。1.2.8样品含量的测定。精确称取不同批号（批号100411、100412和100413）的样品配制成供试品溶液，按“1.2.3”方法测定各样品的吸光度值，根据标准曲线计算3批样品中葡萄糖醛酸浓度求得葡萄糖醛酸含量，通过以下换算公式得到硫酸软骨素的含量［6］。硫酸软骨素含量=葡萄糖醛酸含m/45.12%x100%(1)2结果与分析2.1标准曲线由图1可知，D-葡萄糖醛酸浓度与吸光度在10~50pg/ml范围内具有良好的线性关系，其标准曲线方程为Y=0.015X-0.037(r=0.9997),其中Y为吸光度，X为D-葡萄糖醛酸浓度(pg/ml)。图1D-葡萄糖醛酸的标准曲线Fig.lCalibrationcurveofD-glucuronicacid2.2精密度试验低、中、高3个不同浓度溶液的RSD值分别为1.45%、1.02%和1.16%，说明此方法的精密度良好。2.3稳定性试验RSD值为0.66%。吸收值变化很小，溶液吸光度在显色40min内基本保持不变，在lh内吸光度约下降1.11%，表明溶液显色后稳定性良好。2.4重现性试验RSD值为2.79%，说明该方法具有良好的重现性。2.5加样回收率试验低、中、高浓度的加样回收率分别为100.87%、100.73%和101.29%(n=5)，其RSD值分别为2.74%、2.56%和2.22%，说明该方法具有较高的回收率。2.6样品含量的测定结果批号100411、100412及100413的葡萄糖醛酸含量分别是26.55%、26.58%和26.63%，其对应的硫酸软骨素含量分别为58.41%、58.48%和58.59%。3小结该试验建立了采用咔唑法测定中华鲟软骨中硫酸软骨素的方法。D-葡萄糖醛酸浓度在10~50pg/ml范围内与吸光度呈良好的线性关系，回归方程为Y=0.015X-0.037(r=0.9997),低、中、高3个不同浓度的加样回收率分别为100.87%、100.73%及101.29%(n=5),其RSD值分别为2.74%、2.56%和2.22%，溶液lh内稳定性好。该方法操作简单，不需要精密和贵重仪器，无需硫酸软骨素标准品，重现性好，精密度高，可为中华鲟软骨中硫酸软骨素的工艺研究提供简便、快速的测定方法。参考文献[1]孙丰梅.硫酸软骨素的提取及其降血脂、抗氧化保健功能的研究[D].保定:河北农业大学，2003.[2]谢继青，王凤仙，崔慧斐，等硫酸软骨素含量测定操作条件的优化[J].中国生化药物杂志，2000