紫外可见分光光度法46张课件

概述基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称吸光光度法，它包括比色法和分光光度法。紫外-可见分光光度法是研究物质在紫外、可见光区的分子吸收光谱的分析方法。它属于分子光谱法的一种，是利用某些物质的分子吸收200～800nm光谱区的辐射来进行分析测定的方法。这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁，广泛用于无机和有机物质的定性、定量测定。2023/8/141概述基于物质对光的选择性吸收而建立当一束太阳光照射某一溶液时，太阳光中某一颜色的光被吸收，其互补色光透过溶液，刺激人的眼睛，使人感觉到它的颜色。溶液颜色与光吸收的关系可见光波长及其互补光实例：1)高锰酸钾吸收绿光显紫红色；2)重铬酸钾吸收蓝光显黄色；3)邻菲罗啉铁溶液吸收蓝绿光显红色。2023/8/142当一束太阳光照射某一溶液时，太阳光中某完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光2023/8/143完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光2023

根据溶液的颜色，可以估计该溶液吸收的光的波长。

/nm颜色互补色400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙绿蓝650-760红蓝绿2023/8/144根据溶液的颜色，可以估计该溶液吸收的光的波长。/n分光光度法的发展过程分光光度法在发展过程中先后经过了目视比色法，光电比色法和分光光度法三个阶段。（1）目视比色法是一种用眼睛辨别颜色深浅，以确定待测组分含量的方法。（2）光电比色法是使用光电比色计测量溶液吸光度并计算待测组分含量。（3）分光光度法是应用分光光度计，通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度，对该物质进行定性、定量分析的方法。它包括紫外分光光度法、可见光分光光度法、红外分光光度法等。

2023/8/145分光光度法的发展过程分光光度法在发展过程中先后经测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度(即吸光度A)，然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条曲线，称为吸收光谱曲线(简称吸收曲线)。吸收光谱示意图吸收曲线及常用术语2023/8/146测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度(透过光的强度It与入射光的强度I0之比称为透光度，用T表示。常用百分数表示：T=It/I0

为了表示物质对光的吸收程度，常采用吸光度A这一概念，即透光度倒数的对数值。A=lg（I0/It）=lg（1/T）=－lgT

1.透光度T和吸光度A

朗伯—比耳定律2023/8/147透过光的强度It与入射光的强度I02.朗伯—比耳定律

布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。

A∝b

1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系。

A∝c

二者的结合称为朗伯—比耳定律，其数学表达式为：

A=εbc

朗伯—比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。2023/8/1482.朗伯—比耳定律2023/8/28

A=εbc

式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；

b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；

c：溶液的摩尔浓度，单位mol·L-1；

ε：摩尔吸收系数，单位L·mol-1·cm-1。（讲解78页例题）

摩尔吸收系数越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。

ε>105：超高灵敏；

ε=(6～10）×104：高灵敏；

ε<2×104

：不灵敏。摩尔吸收系数2023/8/149A=εbc摩尔吸光度的加和性在某一波长下，当溶液中含有多种物质成分时，如果它们之间不发生化学反应，则体系在该波长的总吸光度等于各组分吸光度之和，称之为吸光度的加和定律。

A＝A1十A2十…十An

＝e1bC1十e2bC2十…十enbCn2023/8/1410吸光度的加和性在某一波长下，当溶液中含

光吸收定律的适用范围朗伯—比耳定律适用于1.使用单色光为入射光；2.溶液均匀，非散射光；3.溶液为稀溶液。

在实际工作中经常发现标准曲线不成直线的情况，特别是当吸光物质的浓度高时。

AC2023/8/1411光吸收定律的适用范围朗伯—比耳定律适用于AC引起偏离朗伯—比耳定律的原因

1非单色光作为入射光引起的偏离

为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好的单色器。此外还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处。图2-4非单色光的影响

2

12023/8/1412引起偏离朗伯—比耳定律的原因1非单色光作为入射光2．溶液浓度的影响

当溶液浓度较大时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了它对光的吸收。因此，朗伯-比耳定律只适用于稀溶液。3．化学反应的影响溶液中存在着解离、缔合、互变异构、配合物的形成等化学平衡，化学平衡与浓度、pH等其他条件密切相关。不同条件可导致吸光质点浓度变化，吸光性质发生变化而偏离朗伯-比耳定律。消除方法为控制反应条件。例如，在铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：2CrO42-+2H+Cr2O72-+H2O。CrO42-、Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不同。用光度法测定CrO42-或Cr2O72-含量时，溶液浓度及酸度的改变都会导致平衡移动而发生对朗伯-比耳定律的偏离，为此应加入强碱或强酸作缓冲溶液以控制酸度。4．非平行光和光散射的影响

当入射光是非平行光时，所有光通过介质的光的光程不同，引起小的偏离。另外，当溶液中含有悬浮物或胶粒等散射质点时，入射光通过溶液时就会有一部分光因散射而损失掉，使透过光强度减小，测得的吸光度增大，从而引起偏离吸收定律。2023/8/14132．溶液浓度的影响2023/8/213紫外可见分光光度计光源单色器吸收池检测器显示系统0.575光源单色器吸收池检测器显示2023/8/1414紫外可见分光光度计光源单色器吸收池检测器显示系统0.575光作用--提供入射光

在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500

nm。

紫外区：氢、氘灯，发射200～375nm的连续光谱。1.光源2023/8/1415作用--提供入射光可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在3

2.单色器

作用：将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光。①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝。2023/8/14162.单色器作用：将光源发射的复合光分解成单3.样品室

样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。

在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。

注意：用作盛空白溶液的比色皿与盛试样溶液的比色皿应互相匹配，即有相同的厚度与相同的透光性。为了减少反射损失，比色皿的光学面必须完全垂直于光束方向。

不能用手指拿比色皿杯的光学面，用后要及时洗涤，可用温水或稀盐酸，乙醇以至铬酸洗液（浓酸中浸泡不要超过15分钟），表面只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净。

2023/8/14173.样品室样品室放置各种类型的吸收池2023/8/4.检测器

利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。5.显示系统

检流计、数字显示、计算机进行仪器自动控制和结果处理。2023/8/14184.检测器5.显示系统2023/8/218紫外可见分光光度计的类型按光路结构可分为：1.单波长单光束分光光度计(如上分厂的721型、722型)；2.单波长双光束分光光度计(如国产710型，730型)；3.双波长双光束分光光度计(如国产WFZ800-5型）2023/8/1419紫外可见分光光度计的类型按光路结构可分为：2023/8/2紫外可见分光光度的使用2023/8/1420紫外可见分光光度的使用2023/8/2202023/8/14212023/8/221721分光光度计操作步骤1.预热仪器。为使测定稳定，将电源开关打开，使仪器预热20min，为了防止光电管疲劳，不要连续光照。预热仪器和不测定时应将比色皿暗箱盖打开，使光路切断。2.选定波长。根据实验要求，转动波长调节器，使指针指示所需要的单色光波长。3.固定灵敏度档。旋动灵敏度档，使其固定于某一档，在实验过程中不再变动。一般测量固定在“1”档。4.调节“0”点。轻轻旋动调“0”电位器，使读数表头指针恰好位于透光度为“0”处（此时，比色皿暗箱盖是打开的，光路被切断，光电管不受光照）。5.调“0”和调“100％”。比色皿中装入参比溶液近4/5,放入比色皿座架的第一格内，其它格内放入样品或标样，把比色皿暗箱盖子轻轻盖上，用参比溶液重复调“0”和“100%”,至仪器稳定。6.测定。轻轻拉动比色皿座架拉杆，使样品或标样溶液进入光路，此时表头指针所示为该溶液的吸光度A。读数后，打开比色皿暗箱盖。7.关机。实验完毕，整理仪器，切断电源。将比色皿取出洗净，并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。2023/8/1422721分光光度计操作步骤1.预热仪器。为使测定稳定，将电源开液晶显示屏氘灯钨灯室操作键盘比色皿室

岛津UV1700紫外可见分光光度计2023/8/1423液晶显示屏氘灯钨灯室操作键盘比色皿室2023/8/223分光光度计使用注意事项

对仪器工作环境的要求稳固的工作台温度、湿度合适

仪器保养和维护方法仪器工作电源光源使用注意事项单色器使用注意事项正确使用吸收池2023/8/1424分光光度计使用注意事项对仪器工作环境的要求仪器保养比色皿的使用(1)要根据所使用的波长来选择比色皿。石英比色皿和普通硅酸盐玻璃比色皿两种。(2)选择配对良好的比色皿。根据国家检定规程的要求比色皿间的偏差不得超过0.5%，所以比色皿在使用之前，要对比色皿进行透光测定，把偏差小于0.5%的比色皿配对使用。(3)选择合适厚度的比色皿。常用比色皿厚度有1、2、3、5、10cm等，在实际分析工作中，通常根据溶液浓度的不同，选用液槽厚度不同的比色皿，使溶液的吸光度控制在0.2～0.7之间。(4)对有挥发性的样品，选择带盖比色皿。1.比色皿的选择2023/8/1425比色皿的使用(1)要根据所使用的波长来选择比色皿。1.比色2.比色皿的使用方法(1)拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。(2)不得将光学面与硬物或脏物接触。(3)测定有色溶液吸光度时，一定要用有色溶液润洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶液的浓度。另外，在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。(4)盛装溶液时，高度为比色皿的4/5处即可。(5)比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干，以保护透光面。(6)凡含有腐蚀玻璃的物质的溶液，不得长期盛放在比色皿中。(7)不能将比色皿放在火焰或电炉上进行加热或干燥箱内烘烤。2023/8/14262.比色皿的使用方法(1)拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的3.比色皿的清洗(1)每次做完实验时，应立即洗净比色皿。清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。如比色皿被有机物沾污，可用盐酸-乙醇混合洗涤液（1:2）浸泡片刻，再用水冲洗。不能用碱溶液或铬酸洗液等氧化性强的洗涤液洗比色皿，以免损坏。(2)不能用毛刷清洗比色皿，以免损伤它的透光面。2023/8/14273.比色皿的清洗2023/8/227显色和分析条件的选择1.入射光波长的选择

一般应该选择λmax为入射光波长。这样可以提高分析结果的准确度和灵敏度。如果λmax处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。2023/8/1428显色和分析条件的选择1.入射光波长的选择2023/8/22浓度测量值的相对误差（Δc/c）不仅与仪器的透光度误差ΔT有关，而且与其透光度读数T的值也有关。ΔT=1%，溶液浓度相对误差Δc/c与其透光度T的关系曲线如右图。由图可见ΔT=1%，T在20%～65%之间时，浓度相对误差较小，此为最佳读数范围。所以要求选择适宜的吸光度范围（0.2-0.7），以使测量结果的误差最小。3.吸光度范围的控制

措施：（a）控制溶液的浓度；（b）选择不同厚度的比色皿，改变光程长度。2.狭缝宽度的选择2023/8/1429浓度测量值的相对误差（Δc/c）不仅与仪器的透

1.显色反应2.对显色反应的要求*灵敏度高:一般ε>104。*选择性好：显色剂仅与被测离子发生显色反应。*对照性好：显色剂在测定波长处无明显吸收,

λmax>60nm。*反应生成的有色化合物组成恒定，稳定。*显色条件易于控制，重现性好。反应条件的选择2023/8/1430

1.显色反应2.对显色反应的要求反应条件的选择2023/8显色反应条件的选择1.显色剂用量

吸光度A与显色剂用量CR的关系会出现如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。2.反应体系的酸度

在相同实验条件下，分别测定不同pH值条件下显色溶液的吸光度。选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的pH范围。3.显色时间与温度

实验确定。4.溶剂

一般尽量采用水相测定。吸光度与pH的关系曲线2023/8/1431显色反应条件的选择1.显色剂用量2.反应体系的酸度吸光度与p参比溶液的选择一般有一下几种情况：1.溶剂参比若仅待测组分与显色剂的反应产物在测定波长处有吸收，而被测试液、显色剂及其他试剂均无吸收，则可用纯溶剂作参比溶液。

2.试剂参比若显色剂或其他试剂在测定波长处略有吸收，而试液本身无吸收，则可用“试剂空白”（不加被测试样的试剂溶液）作参比溶液。3.试液参比

若待测试液本身在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收，可用“试样空白”（不加显色剂的被测试液）作参比溶液。4.其它参比若显色剂、试液中其他组分在测定波长处有吸收，则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂作为参比溶液。5.选择适当的参比溶液2023/8/1432参比溶液的选择一般有一下几种情况：5.选择适当的参比溶液201.干扰(1)与试剂生成有色配合物。如用钼蓝法测定硅时，磷也能生成磷钼蓝，使测定结果偏高。(2)干扰离子本身有颜色。(3)与试剂反应，生成的配合物虽然无色，但要消耗大量显色剂，使被测离子的显色反应不完全。(4)与被测离子结合成离解度小的另一种化合物。使被测离子与显色剂不反应。共存离子的干扰及消除方法2023/8/14331.干扰共存离子的干扰及消除方法2023/8/233（1）控制酸度提高反应的选择性，保证主反应进行完全，以避免干扰。（2）加入掩蔽剂选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。（3）选择适当的参比溶液（4）选择适当的波长（5）利用氧化还原反应改变干扰离子的价态，使干扰离子不与显色剂反应。例如用铬天菁S光度法测定Al3+时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将Fe3+还原为Fe2+，消除Fe3+的干扰。（6）分离干扰离子（7）利用导数光谱、双波长等新技术干扰的消除方法2023/8/1434（1）控制酸度提高反应的选择性，保证主反应进行完全，以避免干定量分析（1）标准曲线法（单组分分析）

配制一系列的标准溶液，其浓度包括待测样品的浓度范围，在干扰少的吸收峰波长处，测定其吸光度A与浓度c的标准曲线，待测样品溶液在相同条件下进行测量，根据测得的吸光度Ai值，从标准曲线上即可查出相应的浓度Ci。

CACiAi0紫外－可见光谱法的应用2023/8/1435定量分析CACiAi0紫外－可见光谱法的应用2023/8/（2）标准对照法（单组分分析）

当样品溶液遵守比耳定律时，可在同样测量条件下测量标准溶液及待测样品溶液，测量到的吸光度分别为A标和A样，根据比耳定律可得到：

式中：C标是已知的，因此待测样品溶液的浓度C样可计算出来。这种方法的误差比标准曲线法要大些，但不需做标准曲线因而要简便些。

2023/8/1436（2）标准对照法（单组分分析）2023/8/236（3）解联立方程法（多组分分析）

以溶液中存在两个组分为例来说明，可在两个波长

1及

2处测量待测溶液的吸光度，设它们分别为A1及A2，则：

A1=exl1bcx+eyl1bcy(在

1处测得A1)

A2=exl2bcx+eyl2bcy(在

2处测得A2)

xl1,eyl1,exl2,eyl2由x,y标液在

1,

2处分别测得2023/8/1437（3）解联立方程法（多组分分析）A1=exl1bc（4）双波长分光光度法（多组分分析）

不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束单色光(λ1和λ2)；以参比波长λ1处的吸光度Aλ1作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。

ΔA

＝Aλ2－Aλ1＝(ελ2－ελ1)bc

两波长处测得的吸光度差值ΔA与待测组分浓度成正比。ελ1和ελ2分别表示待测组分在λ1和λ2处的摩尔吸光系数。

2023/8/1438（4）双波长分光光度法（多组分分析）不需空白溶液作参选择波长组合λ1、λ2的基本要求是：

⑴选定的波长λ1和λ2处干扰组分应具有相同吸光度，即：ΔAy=ΔAyλ2－ΔAyλ1=0故：ΔAx+y=ΔAx=(εxλ2－εxλ1)bcx此时：测得的吸光度差ΔA只与待测组分x的浓度呈线性关系，而与干扰组分y无关。若x为干扰组分，则也可用同样的方法测定y组分。

可采用作图法选择符合上述两个条件的波长组合。

⑵在选定的两个波长λ1和λ2处待测组分的吸光度应具有足够大的差值。2023/8/1439选择波长组合λ1、λ2的基本要求是：⑴选定的波长λ原理

普通分光光度法一般只适于测定微量组分，当待测组分含量较高时，将产生较大的误差。需采用示差分光光度法，简称为示差法。采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度cs(cs<cx)。则：

Ax=εbcx

As=εbcsΔＡ＝Ａx

－Ａs=εb(cx－cs）=εbΔc

测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差ΔＡ。示差法测得的吸光度与Δc呈直线关系。由标准曲线上查得相应的Δc值，则待测溶液浓度cx：

cx=cs+Δc

（5）示差法2023/8/1440原理（5）示差法2023/8/240示差法标尺扩展原理：普通法：cs的T=10%；cx的T=5%示差法