蛋白质性质实验方案

生化试验指导试验一：蛋白质及氨基酸的呈色反响目的：了解构成蛋白质的根本构造单位及主要连接方式。了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反响原理。学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。〔一〕试验原理

白质的定性或定量测定。试验器材及试剂器材：试剂：试验步骤

试管、酒精灯、试管夹、试管架尿素〔2〕10%氢氧化钠溶液〔3〕1%硫酸铜溶液〔4〕2％卵清蛋白溶液取少量尿素结晶，放在枯燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开头硬化时，停顿加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10％氢氧化钠溶1毫升，振荡混匀，再加11滴，再振荡。观看消灭的粉红颜色。避开添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。l102毫升，摇匀，12滴，随加随摇，观看紫玫色的消灭。试验原理α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反响生成蓝紫色物质。1：1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反响，是一种常用的氨基酸定量测定方法。CO2、NH3和同另一个水合茚三酮分于和氨缩合生成有色物质。器材：试剂：

试管、酒精灯、试管夹、试管架(1)蛋白质溶液：2％卵清蛋白或颖鸡蛋清溶液(蛋清：水＝1：9)(2)0.5％甘氨酸溶液0.1％茚三酮水溶液(4)0.1％茚三酮—乙醇溶液试验步骤10.5毫升1—2分钟，观看颜色由粉色变紫红色再变蓝。在一小块滤纸上滴一滴0.5％的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴上一0.1％的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干显色，观看紫红色斑点的消灭。〔三〕黄色反响试验原理式如下：试验器材及试剂器材：试管、酒精灯、试管夹、试管架试剂：鸡蛋清溶液将颖鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用六层纱布过滤。大豆提取液 将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状用纱布过滤。(3)头发 (4)指甲 (5)0.5％苯酚溶液(6)浓硝酸(7)0.3％色氨酸溶液(8)0.3％酪氨酸溶液 (9)10％氢氧化钠溶液试验步骤慢可略放置或用微火加热。待各管消灭黄色后，于室温下逐滴参加10％氢氧化钠溶液至碱性，观看颜色变化。〔四〕考马斯亮蓝反响试验原理作用结合后变为蓝色。A595nm值成正比。常用来测定蛋白质含量。器材：试剂：考马斯亮蓝染液蛋白质样品思考题原理？从本次试验的每个试验中，应当留意的事项都有哪些？试验二蛋白质的等电点测定和沉淀反响一、蛋白质等电点的测定试验目的了解蛋白质的两性解离性质。学习测定蛋白质等电点的一种方法。试验原理蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在以下平衡pH到达肯定质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。酸钠(醋酸钠混合在酪蛋白溶液中)pH值的缓冲液。向诸缓冲溶pH值即为酪蛋白的等电点。器材：200100乳钵试剂：试验步骤

(2)1.00摩尔／升醋酸溶液0.10摩尔／升醋酸溶液0.01摩尔／升醋酸溶液4支，按下表颠序分别准确地参加各试剂，然后混匀。11、2345.9。观看其混浊度。静置分钟后，pH即为酪蛋白的等电点。二、蛋白质的沉淀及变性试验目的试验原理

加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的生疏。了解沉淀蛋白质的几种方法及其有用意义。(3)了解蛋白质变性与沉淀的关系体颗粒，在肯定的理化因素影响下，蛋白质颖拉可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反响可分为两类。(1)可逆的沉淀反响；试验器材及试剂试剂：试验步骤

蛋白质溶液pH4.7醋酸—醋酸钠的缓冲溶液(3)3%硝酸银溶液(4)5％三氯乙酸溶液(5)95％乙醇(6)饱和硫酸铵溶液7)硫酸铵结晶粉末(8)0.1mol/L盐酸溶液0.1mol/L氢氧化钠溶液(10)0.05碳酸钠溶液(11)0.1mol/L醋酸溶液(12)甲基红溶液蛋白质的盐析。无机盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等)浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。铵溶液中才能析出。55毫升于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静么？重金属离子沉淀蛋白质重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。取一支试管，参加蛋白质溶液2毫升，再加31～2滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾出上消液，向沉淀中参加少量的水，沉淀是否溶解？为什么？某些有机酸沉淀蛋白质215％三氯乙酸溶液，振荡淀是否溶解。有机溶剂沉淀蛋白质295％乙醇。混匀，观看沉淀的生成。思考题通过本试验你把握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法?它们的原理?有什么意义？pI是固定常数的吗？质等电点沉淀。依据试验现象，争论以下问题：蛋白质可逆沉淀与不行逆沉淀的本质区分是什么？简述蛋白质的沉淀反响、变性作用和凝固作用的相互关系。试验四氨基酸的分别鉴定―纸层析法试验目的

通过氨基酸的分别，学习纸层析法的根本原理及操作方法把握氨基酸纸上层层析法的操作技术〔点样、平衡、展层、显色、试验原理层析溶剂由有机溶剂和水组成。Rf值(比移)来表示的：Rf=/原点到溶剂前沿的距离Rf值是常数。Rf值的大小与物质的试验利用纸层析法分别氨基酸。器材：层析缸、毛细管、喷雾器、培育皿、层析滤纸试剂：20mL正丁醇15mL5mL置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒人培育皿中备用。氨基酸溶液0.5％的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液(0．5％)。试验步骤将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。取层析滤纸(22cm14cm)2～3cm处用铅2cm作一记号。6个位置上，干后再点一次。每3mm。20mL扩展剂的培育皿，快速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培育皿中(点样的一端在下，1cm)15―20cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界限，自然枯燥或用吹风机热风吹干。显色用喷雾器均匀喷上0。15分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。Rf值。思考题何谓纸层析法?f值?f值的主要因素是什么?3.怎样制备扩展剂?试验目的学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。试验原理35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳质后便可得到纯酪蛋白。器材：试剂：1.颖牛奶2.95%乙醇无水乙醚4.0.2mol/LpH4.7醋酸——醋酸钠缓冲液5.乙醇——乙醚混合液：乙醇∶乙醚=1∶1〔V/V〕试验步骤一〕酪蛋白的粗提40℃、pH4.7的醋酸缓冲液pHpH4.7。5分钟0rn制品。〔二〕酪蛋白的纯化30分钟3n，弃去上清液。用乙醇—22次，抽干。将沉淀摊开在外表上，风干；得酪蛋白纯品准确称重，计算含量和得率。mL牛乳〔g%〕牛乳。测得含量/x100%牛乳。思考题1.制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？2试设计另一种提取酪蛋白的方法试验目的加深对酶的性质的生疏。〔一〕温度对酶活力的影响试验原理37～4050～60℃。100℃，I100℃的溶液中却很快地完全失去活性。试验器材及试剂器材：试剂：0.3％氮化钠溶液。需颖配制。50倍，(稀释倍数可依据各人唾液淀粉酶活性调整)混匀备用。2010100毫升水中。使用前稀释10倍。淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈现的颜色来推断。试验步骤下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈现的颜色来推断。3支试管，编号后按下表参加试剂：1号、337℃恒温水浴中，2号试管放人冰水中。10)用碘化钾—1、2、3管内10分钟后，再用碘液试验，结果如何？〔二〕pH对酶活力的影响试验原理原理pHpH值不同。本试验观看pH6.8。器材：试管及试管架、吸管、滴管、50毫升锥形瓶、恒温水浴。试剂：0.30.5％淀粉溶液50倍的颖唾液(3)0.2摩尔／升磷酸氢二钠溶液(4)0.1摩尔柠檬酸溶液(5)碘化钾—碘溶液(6)pH试纸：pH＝5、pH＝5．8、pH＝6．8、PH＝8四种试验步骤0.2摩尔／升磷酸15080的四种缓冲液。2502毫升。向1I3管取出一滴混合液，置于白1小滴碘化钾—1—2滴碘化钾—碘溶液。添加碘化钾—碘溶1分钟。pH对唾液淀粉酶活性的影响。•〔三〕唾液淀粉酶的活化和抑制试验原理为其抑制剂。器材：(1)恒温水浴试剂：(10.1％淀扮溶液50倍的颖唾液(5)1%硫酸钠溶液碘化钾—碘溶液试验步骤•••••••••试验原理

〔四〕酶的专一性例，来说明酶的专一性。Benedict试剂检查糖的复原性。试验器材及试剂器材：恒温水浴、沸水浴、试管及试管架试剂：(1)2％蔗糖溶液1％淀粉溶液(需颖配制)50倍的颖唾液(4)蔗糖酶溶液(5)Benedict氏试剂•试验步骤思考题1.什么是酶的最适温度及其应用意义？pH？对酶活性有什么影响？3.什么是酶的活化剂？4.什么是酶的抑制剂？与变性剂有何区分？—米氏常数的测定试验目的了解底物浓度对酶促反响的影响。试验原理v──反响初速度〔微摩尔浓度变化n；V──最大反响速度〔微摩尔浓度变化n；S］──底物浓度L──米氏常数〔L。试验原理Km值等于酶促反响速度到达最大反响速度一半时所对应的底物浓度。不同的酶Km值也不同，KmKm值大，说明亲和力小；KmKm值是酶学争论的一个重要方法。大多数纯酶的KmKm值的最常用的简便方法：本试验以胰蛋白酶消化Km值。的数量而跟踪反响，求得初速度。器材：5mL，10mL100mL、25mL碱式滴定管及滴定台、蝴蝶夹、恒温水浴、滴管试剂：0～L〔5%乙醇溶液、NaOH溶液、胰蛋白酶溶液试验步骤5mL10.1MNaOH滴定至微红色，4个瓶颜色应当全都，编号。150mL三角瓶，3710分钟，同时105mL〔同时〕L反响液〔0时样品〕参加一含甲醛的小100.1MNaOH滴定至微弱而持续的微红色。在NaOHmLmL加一滴酚酞，再连续滴至终点，登记NaOHmL数。10mL2号、3号、4号小三NaOHmL数。NaOHmL数〕对时间作图，得始终线，其斜率即初速度为40g/L的酪蛋白浓度。4.30g/L、20g/L、10g/L的酪蛋白溶液，重复上述操作，分别测出V30、V20、V10。3．在〔1〕试验说明，反响速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反响时间的延长，酶促反响速度渐渐下降。缘由有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加pH及温度下局部失活等。因此，争论酶的活力以酶促反响的初速度为准。〔2〕本试验是一个定量测定方法，为获得准确的试验结果，应尽量削减试验操度的准确性。各种试剂的加量也应准确，并严格掌握准确的酶促反响时间。思考题试述底物浓度对酶促反响速度的影响。Km值可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？Km值有何实际应用？试验十三小麦萌发前后淀粉酶活力的比较试验目的学习分光光度计的原理和使用方法。学习测定淀粉酶活力的方法。试验原理芽天数的增长而增加。器材：20mL具塞刻度试管、试管架、刻度吸管、分光光度计试剂：小麦种子、标准麦芽糖溶液LH9l／L1％淀粉溶液、1％3，5-二硝基水杨酸试剂、1％氯化钠溶液、海砂试验步骤种子发芽小麦种子浸泡2.525℃恒温箱内或在室温下发芽。酶液提取取发芽第3415200mg110mL，用力磨碎。在室温下放置20分钟，搅拌几次。然后将提取液离心〔1500r／min〕6～7分钟。将上清液倒入量筒，测定酶提取10倍。2.515粒作为比照〔提取步骤同上。酶活力测定4