分子克隆技术实验讲义

.....分子克隆技术试验讲义黑龙江大学生命科学学院20233月一、试验目的

M14BvM14-glyI基因的克隆与鉴定1、生疏和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。2、学习和把握质粒、T载体的特点。3、学习和把握TA克隆的连接体系及操作要点。4、学习和把握XcmⅠ酶切制备T载体的过程及方法。5、学习和把握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。6、学习并把握热激法转化技术的原理和操作步骤。7、学习并把握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。8、学习并把握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。二、相关学问〔一〕T载体的制备pMD18-TVector是一种高效克隆PCR产物〔T-ACloning〕的商业化专用载体，由pΜC18载体改建而成。在pΜC18XbaⅠ和SalEcoREcoRⅤ进展3′端添加“T〞而成，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。123〕PCR等。〔二〕DNA的重组与连接〔PCR产物的克隆〕把DNA片段从某一类型的载体无性生殖到另一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒，这个过程称为亚克隆。所谓重组，就是把外源目的基因“装进〞载体的过程，即DNA的重组合。为了DNA体DNA伍末端〔compatibleendDNA片段的专用载体，如特地用于克隆PCR产物的载体，大大便利了试验操作。1〕克隆与亚克隆2〕DNA34〕粘性末端与平末端5〕连接6〕连接酶的分类及功能等。〔三〕大肠杆菌感受态细胞的制备外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后，需将其导入受体细胞进展扩增和筛选，得到大量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性生殖，或称为克隆。受体细胞也叫宿主细胞，大肠杆菌宿主菌是目前基因工程最常用的受体细胞。感受态细胞〔competentcell〕是经过确定方法处理后，具有承受外源DNA力气的大肠杆菌，只有开展了感受态的细胞才能稳定地摄取外来的DNA分子。12〕宿主细胞的定义及分类3〕感受态细胞定义及其功能4〕转化定义及方法〔DMSO、MnCl2、TBaq、PEG〕等。〔四〕重组DNA的转化及重组子的鉴定将外源DNADNA分子导入到细菌中产生克隆有两个目的，一是大量产生重组DNA分子，在完成连接反响后，重组DNA分子往往只有纳克级的量，不易操作和进展下一步的分析，假设把重组DNA隆中每一个细胞都含有很多个拷贝的重组DNADNADNA分子进展纯化，在构建重组DNA分子的过程中很难保证体系中不污染其他的DNA分子，连接过程完成以后体系中有多种分子存在，除了需要的重组DNA分子以外，还含有没有连接上的载体分子、没有连接DNADNADNADNA分子，未连接上的载体和DNA片段对试验影响不大，由于它们即使导入细菌细胞，由于不能复制，很快就要被细菌细胞中的酶降解掉；对克隆工作带来影响的是后两种分子，由于它们都为环状，在细菌细胞中都能复制，因而都能产生克隆，但是每个细胞中只能导入一个质粒DNA分子，每个单克隆都是由一个细胞形成的，因此在每个克隆中全部的细胞都只含有同一种质粒。所以只要对不同的克隆进展筛选，就可以鉴定所需的重组DNA分子。所谓的重组子〔recombinant〕也叫做转化子〔transformant〕是指吸取了重组DNA分子的转化细胞。将重组子从其它细胞群中〔如上面提到的对克隆影响较大的自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段screening、宿主细胞的特性以及外源基因在受体细胞表达状况的不同，初步把筛选方法分为直接筛选和间接筛选，直接筛选法又可进一步分为DNA鉴定筛选法、选择性载体筛选法、分子杂交选择法；间接筛选也可以进一步分为免疫学方法、mRNA翻译检测法；本试验承受平板筛选法中的蓝白筛选法。相关学问点：①转化〔transformation〕 质粒〔plasmid〕②转染(transinjection) 噬菌体〔phage〕③显影注射〔1〕导入的方法 ④⑤基因枪 geneblaster⑥脂质体介导法⑦其它方法：快速冷冻法、碳化硅纤维介导法〔2〕重组子：转化子〔3〕重组反响体系中的成分：①②③④⑤⑥〔4〕筛选的方法①直接筛选法

DNA鉴定筛选法：定位、测序选择性载体筛选法：λph包裹、抗药性α-互补分子杂交筛选法：ISH、SouthernBlot免疫化学②间接筛选法

免疫学方法

酶免疫检测mRNA翻译检测法〔五〕质粒DNA的提取〔碱裂解法〕原核生物没有真正的细胞核，DNA一般位于一个类似“核〞的构造——称为类核体上〔由于不是一DNA，的染色体为双股环状DNA，含有1400个以上的基因，另外还有一些质粒DNA。1、质粒的概念质粒是细菌〔如〕染色体外的小型环状双链DNA分子。一般说来，质粒不是细菌生长生殖所必需的构造，就细胞生存而言，质粒是可有可无的。质粒分子本身含有复制功能的遗传构造，故能在细菌内独立地进展复制，并在细胞分裂时恒定地遗传给子代细胞。2、争论质粒的意义〔1〕质粒作为一种暴露的，比病毒更简洁、更有自主复制力气的DNA分子，正好处于生命与非生命的分水岭上。由于质粒能够复制、能够传递、能够表达其遗传信息，说明质粒是独立的有机体，是亚细胞生命体系的成员，是比病毒更简洁的原始生命形态，所以质粒是争论生命起源的一块重要的基石。〔2〕要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具。携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫载体。由于质粒具有遗传传递和遗传交换的力气，因此，质粒作为基因工程的重要运载工具，在现代分子生物学占有重要地位。3、质粒的分类不同的质粒在宿主细胞中的拷数也不同，依据质粒在细胞中拷贝数的多少，Rownd〔1969〕把质粒分为严密型质粒和松弛型质粒。〔1〕严密型质粒〔stringentplasmidDNA的复制与宿主染色体DNA的复制相偶联，受到某种程度的把握，每个细胞仅有1-2个拷贝。〔2〕松驰型质粒〔relaxedplasmid是在松驰把握下进展的，每个细胞的拷贝数约为10～200个。当向培育基中参与氯霉素时，细胞的蛋白DNADNA的复制停顿，松驰型质粒DNA的复制连续进展。松驰型质粒DNA的拷贝数可达数百个，基因工程中使用的质粒都是松弛型质粒。相关学问点：〔1〕质粒的分类：①与宿主相关程度：严密型质粒〔stringentplasmidrelaxed〕②是否有转移基因：接合型质粒、非接合型质粒③带有特别用途的基因：生殖质粒〔FR-col质粒〔编码杀死其他细菌的Ti〕OLS〔2OLS〔3〕质粒的构型：①SC构型：cccDNA(covalentlyclosedcircleDNA)②OC构型：ocDNA(opencircleDNA)③L构型：L-DNA(linearDNA)..三、试验原理〔一〕T载体的制备XcmⅠ是一种Ⅲ型的限制性核酸内切酶，其识别序列为：5′-CCANNNNN^NNNNTGG-3′3′-GGTNNNN^NNNNNACC-5其中阴影局部为XcmⅠ的识别序列，“^〞为Xcm9N〕对XcmⅠ的酶切特异性及酶切效率没有影响。为了能得到用XcmⅠ酶切后3′末端均是T的载体，本试验利用了XcmⅠ的识别序列的特点，引物的3′端带有XcmⅠ酶切位点，其序列如下：Primer：5CGCCCATGCTA^GCGCTGGTAA-′引物中“^〞为XcmⅠ的切割位点，当XcmⅠ对PCR得到的线性片段进展酶切的时候，便会产生一个与T载体形式完全一样的3′-T粘性末端。〔二〕DNA的重组与连接〔PCR产物的克隆〕1988年，Clarke觉察全部的PCRTaqDNA3′3′突出的腺苷酸，由于TaqDNA聚合酶具有非模板介导的核苷酸转移酶活性，可在双链DNA末端加上一个单一3′dATPTaqDNA3′胸腺嘧啶〔dTTPT-A克隆系统，即可直接对PCR产物进展有效的克隆，这样的载体称为T-载体。〔三〕大肠杆菌感受态细胞的制备......20世纪70年月初期开展起来的，当时人们觉察假设把E.coli细胞浸在一冰冷的盐溶液，它吸取DNA分子的力气要比不浸的细胞强；经过摸索和总结，人们最终承受50mmol/L的氯化钙〔CaCl2〕溶液来制备感受态细胞。其他的盐〔如氯化铷RbCl〕也很有效。尽管对这一处理确实切机制仍不清楚，但有人对感受态提出了两种假说，一种认为是细菌细胞壁的局部失去了壁构造或局部溶解，让外源DNA分子通过质膜进入；另一种认为DNA分子能进入细菌细胞是由于细胞处于感受态时外表形成了一种可承受DNA摄取外源DNA分子了。〔四〕重组DNA的转化及重组子的鉴定转化是使重组体DNADNA分子在转化过程中将经受四个阶段，第一个阶段是吸附阶段，完整的双链DNA分子将吸附于感受态细胞的外表；其次个阶段为转入阶段，双链DNA分子解链，以单链的形式进入细胞，而另一链那么被降解；第三阶段是自身稳定阶段，外源质粒在细胞内又复制成双链环状DNA；第四个阶段是表达阶段，即目的基因伴同质粒的复制子一起复制。有些株系的尽管用抗生素抗性基因的插入失活法来筛选重组子很便利，但有的质粒还是承受了其他基因进展筛选，效果同样不错。以pΜC8载体为例，它除了含有氨苄青霉抗性基因以外，还含有一个称为LacZˊβ-LacZLacZLacZˊ的LacZβ-α-肽。这些株系的细胞只在有吸取了像pΜC8LacZˊ基因的质粒分子的状况下才能够合成完整的β-半乳糖苷酶。因此在筛选pΜC8的重组子时，先将转化子涂布于含有氨苄霉素的培育基上培育，然后再通过检测β-又能合成β-半乳糖苷酶的细胞就是重组子细胞。现代化学的开展给我们供给了格外直接地检测β-半乳糖苷酶活性的方法，这种方法涉及一种乳糖的类似物——5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷〔5-bromo-4-chLoro-3-indoLyL-β-D-galactopyranosideX-gal来代替它的长名。β-半乳糖苷酶可以将X-gal分解成一种深蓝色的产物，这个反响是很灵敏的。当带有氨苄青霉素的培育基中加有X-gal及一种β-半乳糖苷酶的诱导物〔异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG〕时，那些能合成完整β-半乳糖苷酶的未重组克隆就会因它能酶解X-galLacZˊ基因被破坏不能合成完整的β-半乳糖苷酶而呈白色，蓝白清楚，重组子的筛选也已泾渭清楚。修饰过的pUC系列质粒↓ ↓修饰的LacZ基因 多LacZ基因LacZ′基因〕↓ ↓β-半乳糖苷酶C末端ω-肽 β-半乳糖苷酶N末端α-肽↓完整的β-半乳糖苷酶↓X-gal/IPTG深蓝色〔五〕质粒DNA的提取〔碱裂解法〕碱裂解法是一种用得最广泛的制备质粒DNA法抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而到达别离目的，当细胞在有NaOH和SDSRNA、DNA发生变性，参与中和液醋酸钾溶液Ⅲ后，溶液变成中性，质粒DNA复性，质粒DNA以原来的构型保存在原溶液中，进展离心，蛋白质与染色体DNA随细胞碎片沉淀下来，质粒DNA那么留在上清液中。这种方法主要用于从小量培育物或同时从很多细胞克隆中进展DNA提取，比较便利和省时，该法提取的DNA纯度较高，不需进一步纯化即可满足测序、PCR等。〔1〕SolutionⅠ：破坏细胞壁。〔2〕SolutionⅡ：高pH值，SDS使宿主染色体DNA和蛋白质变性。〔3〕SolutionⅢ：乙酸钾中和质粒DNA复性、染色体DNA不复性，仍和变形蛋白质缠绕成大的复合物。四、试验过程〔一〕T载体的制备1、pYCQ1载体的质粒提取〔1〕挑取含有质粒pBI121的大肠杆菌单菌落，接种于50mLLBAmp60μg/mL〕液体培育基中，37℃，180r/min12-14h〔2〕取适量培育物参与离心管中，室温8000r/min4min，弃上清，收集菌体。〔3100μL预冷的溶液I参与到离心管中，在旋涡混合器上猛烈振荡，使菌体分散混匀。〔4〕参与溶液II〔1%SDS100μL，0.2mol/LNaOH100μL10次混匀〔不要猛烈振荡〔5〕参与150μL预冷的溶液III，将管缓慢颠倒数次混匀并冰上放置5min后，4℃12000r/min，离4min。〔6〕少量屡次吸取上清转移至管，留神不要引入白色的蛋白质污染。〔7400μL25：24：14℃12000r/min离5min。〔8〕留神移出上清于一离心管中，参与等体积预冷的异丙醇，混匀后冰置10min，以沉淀质粒DNA。4℃12000r/min3min。〔9200μL70%乙醇洗涤沉淀，12000r/min3min，去上清，滤纸吸干多余液体，固体在室温下放置无乙醇味。〔10〕获得的质粒载体pYCQ125μLddH2O，-20℃保存备用。2、PCR扩增反响0.2mLPCR管，冰上建立PCR反响体系，PCR1进展配制。表1 pYCQ1载体的PCR反响体系成分ExTaqBufferddH2OdNTP〔2.5mmol/L〕P1〔10μmol/L〕P2〔10μmol/L〕模板〔质粒载体pYCQ1〕ExTaq酶TotalVolume

用量1.0μL1.0μL1.0μLμL25μL扩增程序：94℃2min；94℃0.5min，50~60℃0.5min，72℃，30个循环；72℃4min，4℃保存。3、XcmI单酶切PCR产物0.2mLPCR管，冰上建立酶切反响体系，酶切反响液按表2进展配制。表2 XcmⅠ酶切反响体系成分XcmⅠBufferPCR扩增产物XcmⅠddH2O

用量25μL加封口膜后才可放入水浴锅中，37h。酶切后，6510min终止酶切反响。〔二〕DNA的重组与连接〔PCR产物的克隆〕4、与PCR产物连接0.2mLPCR管，冰上建立连接反响体系，连接反响液按表3进展配制，161h。表3 连接反响体系成分10×T4DNALigaseBuffer

用量1.0μLddH2OBvM14-glyI基因载体〔XcmⅠ酶切产物〕T4DNALigaseTotalVolume〔三〕大肠杆菌感受态细胞的制备5、DH5α感受态细胞的制备

2.0μL5.0μL1.0μL1.0μL10μL〔137DH5α单菌落，接种于50mLLB液体培育基中，37℃180r/min振荡过夜。〔21%的量〔500μL50mLLB液体培育基中，37℃180r/min1h40min。2〔310mL离心管中，4000r/min45min，去上清，收集菌体，参与5mL预冷30min。2〔4〕4000r/min5min1mL0.1mol/LCaCI2，轻轻悬浮沉淀。〔5〕进展分装，每一个离心管中加约200μL的感受态细胞，4℃保存备用。〔四〕重组DNA的转化及重组子的鉴定6DH5α感受态细胞〔1〕10μL200μL30min。〔2〕4290s90s。〔3890μL37℃的SOC液体培育基，37℃扩培，180r/minlh。〔4X-gal平板。

40μIPT〔4μL〔p60〔5〕待菌体吸附后〔约15min37℃恒温培育箱中培育过夜〔约14-16h计算转化效率。〔61.5mL1mLLB+Amp液体培育基〕中，扩培备用。〔五〕质粒DNA的提取〔碱裂解法〕〔1〕步骤同〔一〕中的质粒的提取步骤。〔2〕将提取的质粒进展1%的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳完毕后凝胶成像系统拍照，检测重组质粒是否构建成功。五、试验要点〔一〕T载体的制备、DNA的重组与连接〔PCR产物的克隆〕由于本试验使用的载体为T载体，所以不需要插入片段与载体的同时酶切。假设需要在酶切反响之后再进展连接反响时，应留意以下两点：〔1〕限制性内切酶未能完全被灭活，使用乙醇沉淀可防止这一问题的发生。〔2〕DNA样品中混有可影响连接活性的杂质，酶解后的DNA直接用于连接时而不经过乙醇沉淀重溶于无菌蒸馏水中时常常会遇到这种问题。〔二〕大肠杆菌感受态细胞的制备1、商品化的感受态细胞有PH525、JB101、Top10、DH5-2。2、对所用试剂如CaCl2的要求很高，要留意质量与浓度。3、用CaCl2法制备的感受态细胞4℃放置过夜后感受态效率提高。4、感受态细胞对冻融格外敏感。化冻的细胞不应重复冷冻，假设冰箱出了故障那么应弃去并重制备。〔三〕重组DNA的转化及重组子的鉴定1、通常蓝色显色不太完全，可以将平板置于冰箱中放置过夜使颜色变深。2、试验中应作比照，通常比照是取局部感受态细胞，用未酶解的载体质粒进展转化，应当得到一块长满蓝色克隆的平板，证明感受态细胞是好的。3、除比照外，假设其他板上一个菌落也没有。消灭这种问题的缘由可能是连接酶失活，应当更换。4、平板上的菌长成菌苔状，消灭这种状况可能有如下两个缘由：〔1生素活性较低，在培育基未能充份冷却时即参与抗生素可能导致抗生素局部失活。〔2〕菌株可能获得了含有抗生素抗性基因的质粒。这时应使用颖氨苄青霉素重配制LB平板，同时配制不含抗生素的平板，将贮存的细菌分别涂在两种平板上，假设该菌株能在含有氨苄青霉素的平板上生长，那么说明该菌获得了某个质粒，应弃之，并且制备颖菌；假设细菌在不含抗生素的平板上生长，在含氨苄青霉素的平板上不能生长，那么说明在转化试验中所使用的平板或者没加抗生素，或者抗生素浓度不够。〔五〕质粒DNA的提取〔碱裂解法〕参与溶液Ⅱ进展蛋白质的变性过程中要记住两点1〕时间不能过长，由于在这样的碱性条件下基因组DNA2DNA也会断裂，这样会带来很多麻烦。六、试验仪器及耗材12Vortex2、耗材：0.2mLPCR1.5mL离心管、10mL离心管、液氮〔罐脱脂棉、Tip七、试验主要试剂及配制方法〔一〕试验主要试剂1、T载体的制备Amp抗生素、胰化蛋白胨、酵母提取物、NaCl、NaOH、SDS、苯酚-氯仿-异戊醇〔25：24：1丙醇、乙酸钾、冰乙酸、70%乙醇、氯霉素、引物、ExTaq酶、dNTP、XcmⅠ酶、Buffer、ddH2O。2、DNA的重组与连接〔PCR产物的克隆〕PCR产物〔插入DNApMD20-T载体〔大连宝生物生产ddH2O、T4DNA连接酶、Buffer。3、大肠杆菌感受态细胞的制备2胰化蛋白胨、酵母提取物、无菌水、NaCl、NaOH、TOP10DH5αCaCl。24、重组DNA的转化及重组子的鉴定PCR产物连接混合物、感受态细胞、适宜的比照DNA、LB培育基〔每升中含有10g胰蛋白栋、5g酵母浸膏、10gNaCl，用5MNaOHpH7-8LB氨苄青霉素平板〔每升LB15g琼脂，100μg/mL50mg/mLIPTG〔取2g8mL10mL，过滤除菌，-20X-gal20mg/mL，溶于二甲基甲酰胺中，-20SOC培育基。5、质粒DNA的提取〔碱裂解法〕胰化蛋白胨、酵母提取物、NaCl、NaOH、氯霉素〔34mg/mL，溶于乙醇，工作浓度为170μg/mLHB101大肠杆菌菌株、葡萄糖、Tris·HCl、EDTA-Na2·2H2O、SDS、乙酸钾、冰乙酸、乙醇、无菌水、〔二〕配制方法1、LB液体培育基〔不加抗生素〕去离子水 950m胰化蛋白胨母提取物NaCl

10g5g10g5moL/LNaO〔约0.2mpH至7.1151bf/i2〔1.034×105pa20min。2、0.1MCaCl2配制CaCl2加H2O至 200mL〔灭菌〕3、5moL/LNaOH〔NaOH分子量=40〕200gNaOH450mLH2O1L。4、LB培育基〔Lμria-Bertani培育基〕去离子水 950mL细菌培育用胰化蛋白胨〔bacto-tryptone〕 10g细菌培育用酵母提取物〔bacto-yeastextract〕 5gNaCl 10g摇动容器直至完全溶解，用5moL/LNaOH0.2mL〕调整pH7.0，参与