食品中一般成分的分析-食品中蛋白质和氨基酸的测定

任务五食品中蛋白质的测定难点：

基本知识点：重点：1.折射法的原理2.旋光法的原理1.凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量。1.食品中蛋白质的组成，性质及检测意义；各种测定蛋白质的原理、操作要点及注意事项；3.凯氏定氮仪的使用。

2.各种测定蛋白质的原理、适用范围及操作要点。

一、蛋白质的结构、组成、作用及分布

蛋白质是由20多种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，并具有复杂的空间结构。蛋白质的最小构成单元是氨基酸。

（一）蛋白质的结构丙、精、天冬、半胱、谷、组、异亮、甘、天冬、亮、赖、甲硫、苯丙、脯、丝、苏、色、酪、缬（二）蛋白质的化学组成

蛋白质主要含的元素是C、H、O、N、S、P另外还有一些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。含N是蛋白质区别于其他有机化合物的重要标志。 （二）蛋白质的生理功能及在食品中的作用1．生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，是生物体发育及修补组织的原料，长期蛋白质不足会造成负氮平衡。2．生物体的酸碱平衡、水平衡的维持；3．遗传信息的表达方式；4．物质的代谢及运转都与蛋白质有关（酶）；5．人体重要的营养物质；6．膳食指导的重要（营养）指标；7．食品生产的重要工艺指标，还关系到人体健康。（三）食物中蛋白质的含量食物品种蛋白质含量（％）食物品种蛋白质含量（％）人乳1.5大米5.2～7.6牛乳3.2～3.3白面9.8～13.5全脂奶粉22～25玉米面7.0～9.4脱脂奶粉34～38黄豆33～42猪肉9.5花生25～38牛肉干81～90核桃15～21全蛋粉35土豆10～13脱脂蛋粉77绿藻23～44二、蛋白质的物理化学性质N是区别于其它有机化合物的主要标志N在蛋白质的含量是相对衡定的，平均在16%左右。（一）构成元素—N元素

蛋白质中的AA是通过酰胺键结合的，在碱性条件下，具有酰胺键的化合物可与硫酸铜生成紫色的的络合物（“茚三酮”反应）。蛋白质可以与茚三酮显色，生成紫红色的显色产物，可用于比色分析。（二）结构特征与对应的反应特性1.双缩脲反应—酰胺键3.对紫外光的特征性的吸收作用

酰氨键在190nm和芳香族的AA在280nm下具有最大吸光度，以此为依据可用紫外分光光度法测定蛋白质的含量。

蛋白质的侧链中有许多酸、碱性基团，使蛋白质的溶液呈现碱性或酸性；能够吸附色素，并与其生成“蛋白质-色素”的沉淀。可用色素结合法进行比色分析。2.色素沉淀反应—酸碱性加热；重金属盐类；碱性、酸性条件下；高浓度的盐；醇、酚类物质（三）蛋白质的沉淀

蛋白质易变性并沉淀，可利用分离沉淀法即重量分析法测定蛋白质的含量。三、蛋白质的测定方法和蛋白质换算系数1．分离称量（重量分析法）；2．放射性同位素法；3．折光法。1．凯氏定氮法（凯氏系列定氮法）2．容量分析法1．双缩脲法（缩二脲法）；2．色素结合法；3．紫外分光光度法；4．酚试剂法。物理分析法比色分析法化学分析法（一）测定方法含N量的倒数称为蛋白质换算系数（K=6.25）。测定时，总氮乘蛋白质换称系数即为蛋白质含量。（二）蛋白质换算系数蛋白质组成元素CHONSP百分比50723160～30～3GB5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》第一法丹麦人凯道尔（J.Kjeldah）1883年提出

凯氏定氮法有常量法、微量法及改良法，其原理基本相同，只是所使用的样品数量和仪器不同。

凯氏定氮法是将蛋白质消化，测定其总N量，再换算成为蛋白质含量。食品中的含N物质，除蛋白质中的氮以外，还包括氨基酸、酰胺、核酸等中的氮等少量的非蛋白质含N物质，所以该法测定的蛋白质含量应称为粗蛋白质。1.测定原理

样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。2.反应式及计算关系：2NaOH＋(NH4)2SO4＝

2NH3＋Na2SO4＋2H2O2NH3+

4H3BO3=(NH4)2B4O7（弱碱性）+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3N：HCl=1：1食品CHON＋H2SO4催化剂CO2H2O(NH4)2SO4消化蒸馏吸收滴定3.试剂

3.试剂与仪器硫酸铜硫酸钾浓硫酸。40％氢氧化钠硼酸指示剂:甲基红-溴甲酚绿混合指示剂

（1）硫酸铜的作用①催化剂可采用的催化剂有：铜、汞、硒粉。②指示剂3C+4CuSO4+2

H2SO4→2Cu2SO4+4SO2↑+3CO2↑+2H2O

Cu2SO4+2H2SO4→2CuSO4+2H2O+SO2↑

（2）浓硫酸的作用①氧化剂②脱水、碳化碳化（变黑、起泡）→泡沫消失（仍黑色）→酱色→变棕色→变浅→透明

──如加CuSO4，则呈蓝绿色；──如未加CuSO4，则为无色。（3）硫酸钾的作用K2SO4

或Na2SO4是常用的增温剂，提高消化液沸点。在消化过程中温度起着重要的作用，消化温度一般控制在360℃～410℃间。低于360℃，消化不易完全，特别是杂环氮化物，不易分解，使结果偏低，高于410℃则容易引氮的损失。

H2SO4的沸点仅为330℃。K2SO4

沸点：400℃；在消化过程中，随着H2SO4的不断分解，水分不断蒸发，K2SO4浓度逐渐升高，则沸点升高，加速对有机物的分解作用。4.分析步骤（1）样品消化①固体样品0.2～2.0g，半固体样品2～5g，溶液样品15～25mL移入干燥的凯氏烧瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入0.5～1g硫酸铜、10g硫酸钾及25mL浓硫酸小心摇匀，于瓶口置一小漏斗，45°角倾斜置电炉上通风橱内加热消化。

②先小火加热，待内容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力消化（经常转动烧瓶）至溶液呈澄清透明的蓝绿色（为加快消化速度,可分数次加入10mL30%过氧化氢溶液，但必须将烧瓶冷却数分钟以后加入！）。取下漏斗，继续加热0.5h～1h，冷却至室温。①按图装好蒸馏装置（2）蒸馏、吸收②蒸馏

第一步：水蒸气发生瓶装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。在接受瓶内加入10mL40g/L硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。第二步：吸取10.00mL样品消化稀释液，由进样漏斗进入反应室，以少量水冲洗进样漏斗，并流入反应室。再从进样口加入400g/L氢氧化钠10mL使溶液呈强碱性，用少量蒸馏水洗漏斗数次，盖塞，进行水蒸气蒸馏。第三步：蒸馏瓶变为绿色开始记时，继续蒸馏10min后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。（3）滴定

将接受瓶内的硼酸液用0.1mol/L盐酸标准溶液滴定至终点，即反应液由蓝绿色转为灰紫色。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。5.结果计算式中w—蛋白质的质量分数，%；

c—盐酸标准液的浓度，mol/L；

V1—空白滴定消耗标准液量，mL；

V2—试剂滴定消耗标准液量，mL；

m—样品质量，g；0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol；

F—蛋白质系数。计算结果保留三位有效数字。（1）所用试剂应用无氨蒸馏水配制。（2）消化时转动凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的炭粒冲下，以促进消化完全。（3）样品含脂肪或糖较多时，加少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂，防

止其溢出瓶外，并注意适当控制热源强度。（4）若样品消化液不易澄清透明，可将凯氏烧瓶冷却，加入300g/L2～

3mL过氧化氢后再加热。（5）若取样量较大，可按每克试样5mL的比例增加硫酸用量。（6）消化时间一般约4小时左右即可，消化时间过长会引起氨的损失。

一般消化至透明后，继续消化30min即可。有机物如分解完全，分

解液呈蓝色或浅绿色。但含铁量多时，呈较深绿色。6.说明及注意事项（7）蒸馏过程应注意接头处无松漏现象，蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。（8）硼酸吸收液的温度不应超过40°C，否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。（9）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。二、乙酰丙酮-甲醛比色法1.测定原理

食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中，铵与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3，5-二乙酰-2，6-二甲基-1，4二氢化吡啶化合物，在波长400nm处测定吸光度，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。2.仪器分光光度计；电热恒温水浴锅(100℃±0.5℃)；10mL具塞玻璃比色管。GB/T5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》第二法样品消化用试剂：同凯氏定氮法氢氧化钠溶液(300g/L)：对硝基苯酚指示剂溶液(1g/L)

乙酸溶液(1mol/L)

乙酸钠溶液(1mol/L)乙酸钠－乙酸缓冲溶液3.试剂

氨氮标准储备溶液(l.0g/L)氨氮标准使用溶液(0.1g/L）二、乙酰丙酮-甲醛比色法（1）试样消解

同凯氏定氮（2）试样溶液的制备

精密吸取2mL～5mL试样或试剂空白消化液于50mL～100mL容量瓶内，加1滴～2滴对硝基酚指示剂溶液(1g/L)，摇匀后滴加氢氧化钠溶液(300g/L)中和至黄色，再滴加乙酸(1mol/L)至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。4.分析步骤二、乙酰丙酮-甲醛比色法（3）标准曲线的绘制

精密吸取0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL氨氮标准使用溶液（相当于NH2－N0，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0μg），分别置于10mL比色管中。加4mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液(pH4.8)及4mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于100℃水浴中加热15min。取出用水冷却至室温后，移入1cm比色皿内，以零管为参比，于波长400nm处测量吸光度，根据标准各点吸光度绘制标准曲线或计算直线回归方程。二、乙酰丙酮-甲醛比色法（4）试样测定

精密吸取0.5mL～2.0mL(约相当于氮小于1001μg)试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于10mL比色管中。加4mL乙酸钠－乙酸缓冲溶液(pH4.8)及4mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于100℃水浴中加热15min。取出用水冷却至室温后，移入1cm比色皿内，以零管为参比，于波长400nm处测量吸光度，根据标准各点吸光度绘制标准曲线或计算直线回归方程。试样吸光度与标准曲线比较定量或代入标准回归方程求出含量。二、乙酰丙酮-甲醛比色法5.计算结果式中:w—试样中蛋白质的含量，(g/100g或g/100mL)；cco—试剂空白测定液中氮的含量，(μg)；c—试样测定液中氮的含量，(μg)；V1—试样消化液定容体积，(mL);V2—制备试样溶液的消化液体积，(mL);V3—