中药制剂的含量测定

第五章中药制剂的含量测定

学习目标1.解释化学分析法、紫外-可见分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法、气相色谱法原理以及在中药制剂分析中的应用2.说出含量测定方法各效能指标的含义3.知道荧光分析法、原子吸收分光光度法原理和应用第一节含量测定的目的与意义

在我国药品质量标准中，[鉴别]、[检查]和[含量测定]项目是判定中药制剂质量优劣的标准。

中药制剂的鉴别是研究某种原料药或成分的存在与否，从而判定药物的真伪，而含量测定项目是研究某种成分的含量高低是否符合规定来判定药物的优劣。中药制剂的含量测定是质量控制中的一项重要指标。

通过测定制剂中有效成分、毒性成分或某些指标性成分的含量来衡量其制剂工艺的稳定性和中药材的质量优劣，以保证中药制剂的质量，达到临床用药安全、有效和中药制剂进入国际市场的需要。

有效成分毒性成分指标性成分衡量工艺、保证质量第二节常用定量分析方法

一、化学分析法分类重量分析滴定分析特点仪器简单结果准确测定：含量较高成分矿物药制剂中无机成分如总生物碱类、总酸类、总皂苷及矿物药制剂等。

化学分析法有一定的局限性，其灵敏度低，操作繁琐、耗时长，专属性不高，对于微量成分准确性不理想。（一）重量分析法挥发法萃取法沉淀法如：①供试品的干燥失重测定；②水分测定均属挥发法；③中药制剂分析中灰分及炽灼残渣的测定等。挥发法测定具有挥发性或能定量转化为挥发性物质的组分含量。萃取法根据被测组分在互不相溶的两相中溶解度的不同，达到分离的目的。如：①冰硼散中冰片的含量测定；②地奥心血康胶囊中甾体总皂苷含量测定；③昆明山海棠片中总生物碱的含量测定；④甘草浸膏中甘草酸的含量测定即采用萃取法。沉淀法将被测组分定量转化为难溶化合物，测定其含量的方法，适用于制剂中纯度较高的成分。如：①西瓜霜润喉片中西瓜霜的含量测定；②苦参片中苦参总碱的含量测定；③复方元胡注射液总碱的测定。（二）滴定分析法酸碱滴定法沉淀滴定法配位滴定法氧化还原滴定法酸碱滴定法适用于测定中药制剂中所含有的生物碱、有机酸、内酯类等酸、碱组分的含量。沉淀滴定法主要用于生物碱、生物碱的氢卤酸盐及含卤素的其他有机成分的含量测定。滴定开始砖红色滴定终点用AgNO3滴定液滴定氯化物

Ag++Cl-→AgCl↓2Ag++CrO42-→Ag2CrO4↓铬酸钾指示剂如：①万氏牛黄清心丸等的含量测定就采用硫氰酸铵法；②牛黄解毒片中石膏的含量测定。配位滴定法包括EDTA法和硫氰酸铵法，在中药制剂分析中，用以测定鞣质、生物碱及含Ca2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等矿物类制剂的含量。如：①磁朱丸中全铁的含量测定采用铈量法；②牛黄解毒片中雄黄的含量测定；③丹皮酚注射液中丹皮酚的含量测。

氧化还原滴定法适用于测定具有氧化还原性的物质，如含酚类、糖类及矿物药Fe、As等成分的中药制剂。该法是中药及其制剂含量测定的一种常用方法。二、可见-紫外分光光度法优点灵敏度高精度好操作简便该法要求被测成分本身或其显色产物对可见-紫外光具有选择性吸收。按测定波长数目不同分为单波长光谱法和多波长光谱法。实际应用中常用单波长光谱法。

分类方法特点吸收系数法测定所配供试品溶液在规定波长的吸收度，根据被测成分的吸收系数（E1%1cm）计算其含量①对仪器要求高，使用该法时，应注意仪器波长、空白吸收的校正，吸收度准确度的检定和杂散光的检查②无需对照品，方法简便对照品比较法在同样条件下配制对照品溶液和供试溶液，且使前者中所含被测成分的量应为后者中被测成分的量的100%±10%，用规定波测定二者的吸收度，则可计算出供试品中被测成分的浓度或含量对仪器要求较高标准曲线法配制一系列不同浓度的对照品溶液（常为5个），在相同条件下分别测定吸收度，绘制A-C曲线，或求出其回归直线方程（相关系数r≥0.999），即得标准曲线。在相同条件下，测定供试品溶液的吸收度，就可求得供试品中被测成分的浓度或含量。①本法对仪器的精度要求不高，有时标准曲线不通过原点，只要重现性好也可使用②该法在比色法中最常用薄层扫描法是用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、杂质检查或含量测定。三、薄层扫描法

薄层扫描法是以薄层色谱法为基础发展起来的薄层色谱组分原位分析方法及薄层色谱的记录方法，又称薄层色谱扫描法（TLCS），相应仪器称为薄层扫描仪（ThinLayerChromatogramScanner）。（一）基本原理

薄层扫描法是指薄层色谱斑点的色谱扫描，薄层色谱扫描是指固定波长，斑点移动，测定A-l或F-l曲线。根据薄层扫描的测定方式分为薄层吸收扫描法和薄层荧光扫描法二种方法。1、薄层吸收扫描法

基本原理：Kubelka-Munk理论及曲线。由于薄层板存在明显的散射现象，斑点中物质的浓度与吸光度的关系需用Kubelka-Munk理论及曲线来描述。Kubelka-Munk理论以斑点的相对反射率和相对透光率计算薄层色谱斑点的吸光度，说明了固定相的散射参数SX对斑点中物质的浓度与吸光度间关系的影响，获得不同散射参数SX时斑点的A-KX理论曲线，即Kubelka-Munk曲线。光源：钨灯和氘灯；灵敏度：在200-800nm波长范围内选择合适波长进行测定，其灵敏度可达ng级；适用范围：适用于在可见、紫外区有吸收的物质，及通过色谱前或色谱后衍生成上述化合物的样品组分。2、薄层荧光扫描法基本原理：F=2.3K’I。ECL或F=KC光源：氙灯或汞灯。灵敏度：最低可测到10-50pg。适用范围：适合于本身具有荧光或经过适当处理后可产生荧光的物质的测定。

Kubelka-Munk理论不适用于薄层荧光扫描，无需进行曲线校直。用薄层荧光扫描进行定量分析时，用斑点荧光强度的积分值（色谱峰峰面积）与斑点中组分的含量代替上式中F与C进行运算。（二）定量分析方法外标法内标法追加法回归曲线①外标一点法工作曲线通过原点（截距为零）时可用外标一点法定量。只需点一种浓度的标准品溶液，与供试液同板展开，对比，测定组分含量，其计算公式为：C=F1·A

式中：C为组分的重量或浓度，A为测得该组分的峰面积，F1为直线的斜率或比例常数。外标法外标法是薄层色谱扫描最常用的定量方法，方法简便，但点样必须准确。②外标二点法工作曲线不通过原点时，只能用外标二点法定量，至少需点二种不同浓度的标准溶液（或一种浓度两种点样量），才能决定一直线,其计算公式为：C=F1A+F2式中：C、A同前，F1为直线的斜率或比例常数，F2为纵坐标的截距，F1和F2值由仪器自动算出。

外标一点法、二点法只是指用一种或二种浓度的标准溶液对比定量，为减小误差，同一薄板上供试品点样不得少于4个，对照品每一浓度不得少于2个；并调整标淮溶液的浓度或供试品与标准溶液的点样量，使其峰面积相接近；且点样量必须准确，宜用定量毛细管点样。

内标物的选择要求是：

纯度合乎要求，展开后不得有杂质斑点，否则内标斑点的峰面积将不能代表内标物的量。内标物须为样品中所不含有的成分。内标物不与其它斑点相重叠，分离度合乎要求。为简化计算，内标物在标准溶液及供试品溶液中的浓度应相等。内标法内标法是选一个纯物质作为内标物，并准确称取一定量内标物加至供试液及标准液中，计算供试品溶液中某组分含量的定量方法。特点：1）在一定点样量范围内，内标法定量准确度与点样量无关。

2）不易找到适宜Rf值的纯品内标物，且溶液配制等操作较麻烦。方法：1）内标一点法：当工作曲线通过原点时采用内标一点法。内标一点法公式：

2）工作曲线不通过原点时必须采用内标二点法内标二点法公式：

式中：C、Cis分别为组分及内标物的浓度或重量，A、Ais分别为测得组分及内标物的峰面积，F1为直线的斜率或比例常数，F2为截距，F1和F2由仪器自动计算并内存，可直接给出样品的浓度或重量。适用于成分复杂供试品的定量分析，既具有内标法的特点又不需要内标物，详见HPLC法。追加法（叠加法）将不同浓度（或不同量）的标准溶液与供试液点在同一块薄层板上，展开、扫描由计算机对所测得的峰面积及相应点样量进行线性或非线性回归直接由回归方程或回归曲线计算供试液含量的方法。

CAMAG系列薄层扫描仪即采用此方法。回归曲线定量法（三）操作要点（1）线性考察

①检查所选择的散射参数SX值是否适宜。SX值适宜则工作曲线被校直为直线，否则，调整SX值再校正，直至在一定点样量范围内工作曲线成直线为止。②考察工作曲线是否过原点，以便确定采用一点法或二点法定量。③确定点样量的线性范围。既使采用曲线校直，也只是在一定点样量范围内工作曲线为直线，因此需确定点样量的上、下限。为降低定量误差，最好调整点样量，使供试品与对照品的峰面积相接近。为了克服薄层板间差异，外标法及内标法均应采用随行标准法，即标准溶液与供试品溶液交叉点在同一块薄层板上。（2）精密度考察

取同一供试品溶液，在同一块薄层板上以相同点样量平行点5点以上，展开后测定其峰面积，求算相对标准差（RSD），作为衡量定量分析结果精密度的指标。RSD应小于4%。

式中：为n次测量的平均值，S为标准差。（3）准确度考察

回收率是衡量定量方法准确度的指标，常用加样回收率（R）来衡量，其值应在95-105%之间，测量数据一般为5-6个。将加入纯品的试样溶液、供试品溶液及标准溶液点于同一块薄层板上，展开后进行薄层扫描，测定各斑点的峰面积，计算各溶液中组分的量，计算回收率（R）。薄层扫描操作实例四、气相色谱法气相色谱法是以气体为流动相的柱色谱分离分析方法。特点：分离效能高、选择性好、灵敏度高，样品用量少及分析速度快等特点，兼具分离、分析的功能适用范围：适用于热稳定性好的易挥发性或可转化为易挥发性组分的分析。

气相色谱是根据汽化后的试样被载气带入色谱柱，由于各组分在两相间作用不同，在色谱柱中移动有快慢，经一定柱长后得到分离，依次被载气带入检测器，将各组分浓度或质量变化转换成电信号变化记录成色谱图，利用色谱峰保留值进行定性分析，利用峰面积或峰高进行定量分析的方法。（一）基本原理1、塔板理论

将色谱柱的柱效用理论塔板数n或理论塔板高度H衡量，取决于区域宽度（σ、W1/2、W），其计算公式为n=

=5.54

=16

H=L/n

适中：tR为组分的保留时间，σ、W1/2、W分别为组分的标准差、半峰宽和基线宽度。速率理论研究了色谱过程中各种动力学因素对柱效（峰展宽）的影响，提出了VanDeemeter方程式：H=A+B/u+CuA、B/u、Cu分别为涡流扩散项、分子扩散（纵向扩散）项、传质阻抗项，从而解释了板高随载气流速而改变，且有最佳流速（Hmin）的现象。速率方程式对于色谱分离条件的选择具有指导意义，它可以说明色谱柱的填充均匀程度、载体粒度、载气种类、柱温和固定液膜厚度对柱效、峰扩张的影响。

2、速率理论分离度是衡量分离效果的指标，以相邻两色谱峰峰尖距对峰宽均值的倍数表示，其定义式为：R=1两峰基本分离，R≥1.5两峰完全分离。

分离度的影响因素很多，可用基本分离方程式概括如下：a、b、c分别为柱效项，柱选择性项和柱容量项。R==R=

abc3、分离度的计算4、系统适用性试验按药典标准，中药制剂分析时，需按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，既用规定的对照品对仪器进行试验和调整，以达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR和半峰宽Wh/2，按计算色谱柱的理论板数。若测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、柱填充等），使理论板数达到要求。

（1）色谱柱的理论板数n定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其它峰或内标峰之间有较好的分离度，一般R≥1.5。（2）分离度R取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%，也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子，其相对平均偏差也应不大于2.0%。（3）重复性为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子T是否符合各品种项下的规定，或不同浓度进样的校正因子误差是否符合要求。拖尾因子计算公式为：T=

式中，W0.05h为0.05峰高处的峰宽，d1为峰极大至峰前沿之间的距离，除另有规定外，T应在0.95-1.05之间。（4）拖尾因子T1、固定相的选择

气-液色谱①固定液：按极性相似、化学官能团相似的相似性原则和主要差别选择。②载体：一般为适宜粒度，经酸洗并硅烷化处理的硅藻土。气-固色谱固定相大多采用高分子多孔微球（GDX），用于分离水及含羟基（醇）化合物。（二）实验条件的选择沸点300-400℃，采用1-5%低固定液配比，柱温200-250℃。沸点200-300℃，采用5-10%固定液配比，柱温150-180℃。沸点100-200℃，采用10-15%固定液配比，柱温选各组分的平均沸点2/3左右。气体等低沸点样品，采用15-25%高固定液配比，柱温选沸点左右，在室温或50℃下进行分析。对于宽沸程样品，需采用程序升温方法进行分析。

但需注意的是柱温要低于固定液的最高使用温度。2、柱温的选择选择的基本原则：在使最难分离的组分有符合要求的分离度的前提下，尽可能采用较低柱温，但以保留时间适宜及不拖尾为度。在实际工作中一般根据样品的沸点来选择柱温，具体有如下几点：载气流速较低时，宜用N2；流速高时，宜用H2、He；较长色谱柱，宜用H2作载气；热导检测器应选用H2、He；氢焰检测器、电子捕获检测器，一般用N2；

一般控制载气流速高于其最佳流速。常用的载气流速为

20-80ml/min。3、载气的选择主要从对峰展宽（柱效）、柱压降和检测器灵敏度的影响三方面考虑。N2是最常用的载气热导检测器（TCD）：通用型检测器，应用广泛，但灵敏度较低；

氢焰离子化检测器（FID）：应用最广泛，适用于含碳有机物的测定，载气多为N2。

氮-磷检测器（NPD）：专属性检测器，可用于中药及其制剂中农药残留量的检测。

电子捕获检测器（ECD）：专属性检测器，适用于痕量电负性有机物—如含卤素、硫、氧、硝基、羰基、氰基等化合物的分析。4、检测器分类气化室温度：一般采用样品沸点检测室温度：通常可高于柱温30℃左右或等于气化室温度。

进样量：气体样品为0.1-1ml液体样品为0.1-1μl，最大不超过4μl5、其他条件的选择（三）定量分析方法内标法外标法归一化法分类

适用范围：①适用于样品的所有组分不能全部流出色谱柱②检测器不能对每个组分都产生信号③只需测定样品中某几个组分含量时的情况。1、内标法特点：最常用优点：可抵消仪器稳定性差、进样量不够准确等原因所带来的定量分析误差缺点：样品的配制较麻烦，有些内标物不易寻找。关键：选择合适的内标物。原理：选择一内标物，将一定量的内标物加入到样品中，根据试样重量W和内标物重量Ws及待测组分和内标物的峰而积Ai、As，求出待测组分的含量。待测组分百分含量为：Ci%=式中fi、fs分别为被测组分和内标的重量校正因子。在中药制剂分析时，校正因子经常不知，可采用药典方法测定校正因子再用内标法，或采用内标对比法测定。1）工作曲线法：用一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线，在完全相同条件下，准确进样等体积的样品溶液，计算其含量2）外标一点法：当工作曲线截距为零时，可采用外标一点法定量2、外标法①进样量准确②实验条件恒定关键分类关键：要求所有组分均要产生色谱峰。适用范围：通常只能用于粗略考察供试品的杂质含量，一般宜用于微量杂质的含量检查。②校正因子相近采用面积归一化法计算：3、归一化法①校正面积归一化法测定各组分的含量：五、高效液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）是以经典液相色谱法为基础，引入气相色谱的理论和实验方法。高压输送流动相，采用高效固定相及在线检测等手段发展而来的分离分析方法，具有分离效能高、分析速度快及应用范围广等特点。

适用范围：适用于极性、非极性化合物，离子型化合物和高分子化合物的分离分析。HPLC与GC的主要差别是流动相的性质不同。1、塔板理论用于计算理论塔板数及理论塔板高度，衡量色谱柱的柱效。在系统适用性试验中，其理论板数不得低于各品种项下规定的最小理论板数。

H=L/n（一）HPLC的基本原理在HPLC中流动相为液体。粘度大柱温低，扩散系数Dm很小，因此纵向扩散项B/u可忽略不计，其速率方程式为：H=A+CuC=Cm+Csm+Cs式中Cm、Csm、Cs分别是组分在流动相、静态流动相和固定相中的传质阻抗系数。对于化学键合相色谱，“固定液”是被键合在载体表面的单分子层，Cs≈0，则C=Cm+Csm。在HPLC中，当流动相的线速度大于1cm/s时，可近似认为流动相的流速与板高成直线关系，为兼顾柱效与分析速度，一般都采用较低流速。内径2-4.6mm的色谱柱，多采用1ml/min。2、速率理论①大多数药物可用C18反相（ODS）柱加以分离测定；②也可选用正相分配色谱柱（氨基柱、氰基柱）或硅胶吸附色谱柱等；③解离药物可用离子对色谱、离子抑制色谱或离子交换色谱分离测定；④脂溶性药物异构体的分离测定可采用硅胶吸附色谱柱。（二）HPLC实验条件的选择1、色谱柱的选择根据被分离物质的化学结构、极性和溶解度等因素进行选择。反相键合相色谱流动相常用溶剂适用范围部分含水溶剂甲醇-水、乙腈-水系统用于分离中等极性、弱极性药物非水溶剂乙腈-二氯甲烷、甲醇-四氢呋喃等用于分离疏水性物质缓冲溶液三乙胺磷酸盐、磷酸盐、醋酸盐溶液用于可溶于水并具可解离特性的化合物2、流动相的选择

①常采用饱和烷烃（如正已烷）中加入一种极性较大的溶剂作为极性调节剂（如异丙醚），通过调节极性调节剂的浓度改变溶剂强度；

②常采用二元以上的混合溶剂系统。正相键合相色谱①流动相：极性较强的水系统混合溶剂；②常用溶剂：甲醇-水、乙腈-水中加0.003~0.01mol/L的离子对试剂。③影响因素：离子对试剂的性质和浓度；流动相中有机溶剂的性质和比例。反相离子对色谱等度洗脱流动相的组成保持恒定适用于组分数少、性质差别不大的样品。

梯度洗脱程序控制流动相的组成（如溶剂极性、离子强度和pH值等）适用于组分数多、性质相差较大的复杂混合物样品。3、洗脱方式4、检测器

紫外检测器（①可变波长型；②二极管阵列）特点：灵敏度较高，噪音低，线性范围宽，对流速和温度波动不灵敏，可用于梯度洗脱。荧光检测器（FD）特点：用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质，灵敏度高于紫外检测器。电化学检测器（ECD）特点：用于能氧化、还原的有机物质的检测。蒸发光散射检测器（ELSD）特点：属通用型检测器，理论上可用于挥发性低于流动相的任何样品组分，检测灵敏度较低，适用于流动相能挥发的色谱洗脱，不能用含缓冲盐的流动相。示差折光检测器（RID）特点：①属通用型检测器，利用组分与流动相折射率之差进行检测。②稳定性好，操作方便。③灵敏度低、受环境温度、流动相组成等波动的影响大，不适合梯度洗脱。①溶剂的纯化

选择“色谱纯”溶剂

水一般采用石英系统二次蒸馏水5、HPLC前处理流动相的处理②流动相脱气HPLC所用的流动相必须预先除去其中的空气超声波振荡脱气惰性气体（He）鼓泡吹扫脱气抽真空加热法。③过滤过滤是为了防止不溶物堵塞流路和色谱柱入口处的微孔垫片，采用0.45μm以下微孔滤膜过滤。

滤膜分有机溶剂专用和水溶液专用两种。常用的脱气法①待测组分的提取根据样品成分及组分性质选择合适的提取方法和提取条件。自然挥散，适用于小体积样品和挥发性溶剂；减压蒸发，适用于热不稳定样品；冷冻干燥，适用于受热易分解破坏的样品。③滤过样品溶液进样前，需用滤膜抽滤或针头滤器过滤，以有效除去样品溶液中的悬浮物或部分大分子杂质。（0.45μm）②溶剂的挥发样品的处理（三）定量分析方法HPLC法多采用紫外检测器，定量分析方法可采用外标一点法。紫外检测器灵敏度高，待测组分浓度低，标准曲线过原点。进样器有定量环，无需准确进样，可消除进样误差。操作实例六、原子吸收分光光度法测定几乎全部金属元素和一些半金属元素，已广泛应用于中药制剂及中药材中重金属、毒害元素及微量元素的检测。优点灵敏度高选择性和重现性好干扰较少操作简便快速测定范围广

缺点标准工作曲线的线性范围窄测定不同元素一般需用不同光源灯实验条件要求严格原子吸收分光光度法是基于从光源辐射出具有待测元素特征谱线的光，通过试样蒸气时被待测元素的基态原子所吸收，由辐射谱线被减弱的程度（即原子的吸光度）来测定试样中该元素的含量。(一)基本原理（二）定量分析方法标准曲线法、标准加入法、内标法A浓度标准曲线法待测元素S的浓度内标法加入的对照品浓度标准加入法-aAAs/Aiaa（三）样品的处理被测样品溶液样品分解1.无机试样：分解试样（1）酸溶解；（2）碱熔融；（3）微波溶样法。2.有机试样：消化处理后再分解（1）干法消化；（2）湿法消化。准确称取一定量的样品，置于石英坩锅或铂坩锅中，于80~150℃低温加热赶去大量有机物；然后放于高温炉中，加热至450~550℃进行灰化处理。冷却后，再将灰分用HNO3、HCl或其它溶剂进行溶解。如有必要，可加热溶液以使残渣溶解完全，最后转移到容量瓶中，稀释溶液至刻度。样品坩埚（80-150度加热）高温炉（450-550度灰化）硝酸、盐酸或其他溶剂冷却后干法消化:在较高的温度下，用氧来氧化样品。

若使用石墨炉原子化器，则可直接分析固体试样。湿法消化:在样品升温下用合适的酸加以氧化。HCl+HNO3HNO3+HClO4H2SO4+HNO3若用微波溶样技术，可将样品放于聚四氟乙烯焖罐中，于专用微波炉中加热消化样品。根据样品类型决定采用何种混酸消化样品。第四节含量测定方法的效能指标

任何一种分析方法，根据其使用对象和要求，都应有相应的效能指标。分析方法的效能指标可以作为对分析方法的评估尺度，也可作为建立新的分析方法的实验研究依据。常用的效能评价指标有：准确度、精密度、选择性、检测限、定量限、线性与范围、耐用性等。一般以回收率（%）表示。准