琼脂糖凝胶电泳检测dna课件

琼脂糖凝胶电泳检测DNA丁新伦dingxinlun@163.co脂糖凝胶电泳检测DNA丁新伦【一】背景知识凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术；分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。根据制备凝胶的材料:

琼脂糖电泳凝胶电泳聚丙烯酰胺电泳【一】背景知识凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术；【二】实验目的学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法检测碱裂解法提取质粒的结果检测双酶切法鉴定重组质粒的结果检测PCR法鉴定重组质粒的结果【二】实验目的学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法【三】实验原理（1）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的DNA或RNA分子。（2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。【三】实验原理（1）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～6（3）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可判断DNA分子量大小和粗略估计样品DNA浓度。（3）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2琼脂糖是一种线性多糖聚合物。琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的【四】仪器、材料与试剂质粒样品、酶切样品和PCR样品。凝胶电泳系统和电泳图像分析系统(凝胶成像系统)等。琼脂糖、

1XTBE电泳缓冲液、溴化乙锭、

6X载样缓冲液（

6Xloadingbuffer）和DNA分子量标准（

LambdaDNA/EcoRI+HindIIIMarker）等。【四】仪器、材料与试剂质粒样品、酶切样品和PCR样品。凝胶电泳系统DYY-6C型

双稳定时电泳仪电源（北京六一）输出范围（显示分辨率）：6-600V(1V)

4-400mA

(1mA)

240W

美国Bio-rad伯乐小型水平电泳槽Mini-SubCellGTCell凝胶电泳系统DYY-6C型

双稳定时电泳仪电源（北京六一）

凝胶成像分析系统

凝胶成像分析系统LambdaDNA/EcoRI+HindIIIMarker（Ferments）一个已知分子质量的DNA样品做最对照，用来确定待测样品的相对分子质量。LambdaDNA/EcoRI+HindIIIM常用电泳缓冲液缓冲液缓冲容量迁移速度分辨率用途TAE最低最快(高10％)高分子量高高度复杂DNA混合物；超螺旋DNATBE很高较慢低分子量高价格昂贵，不常用TPE常用电泳缓冲液缓冲液缓冲容量迁移速度分辨率用途TAE最低最电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。上样缓冲液电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗溴化乙锭溴化乙锭（3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐EthidiumBromide，EB），EB染色（EB可很好地掺入到双链DNA中），在紫外光下会发出橙红色的荧光，用于对DNA进行染色和观察。用于观察的紫外光有３种波长，一般使用中波紫外光（３０２ｎｍ）。短波紫外光（２５４ｎｍ）观察效果较好，但对DNA的破环很大。长波紫外光（３６６ｎｍ）：回收。溴化乙锭溴化乙锭（3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴琼脂糖凝胶电泳检测dnappt课件琼脂糖凝胶电泳检测dnappt课件EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中或胶中。EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。EB废液要经过处理才能丢弃。SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样品中，价格较昂贵。EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不【五】实验步骤制备琼脂糖凝胶（1%）制备凝胶板加样电泳

染色结果观察

【五】实验步骤制备琼脂糖凝胶（1%）（1）制备凝胶和胶板：

45ml(1×TBE)+0.4g琼脂糖（三角瓶

），

煮胶，溶解，冷却至60℃(不烫手)，倒板(4-6mm)，室温下充分凝固，竖直拔下梳子。胶板设计（44人）：每18孔胶板（5人X3样品+1marker），8胶板每8孔胶板（2人X3样品+1marker），2胶板（1）制备凝胶和胶板：（2

）加样：

5μl质粒DNA+1μlloadingbuffer

，混匀15μlPCR产物+3μlloadingbuffer，混匀10μl酶切产物+2μlloadingbuffer，混匀6μlDNAMark（每板胶加一孔）（3）电泳：电压3-5V/cm，约80-90V，注意电极方向（4）染色：EB染