氧化还原滴定法基本原理课件

第四章药典中常见定量分析方法概述第四章药典中常见定量分析方法概述1药物的定量分析准确测定药品有效成分或指标性成分的含量，是评价药品质量、判断药物优劣的重要手段。分类：化学分析法

仪器分析法重量分析滴定分析色谱法分光光度法电化学分析药物的定量分析准确测定药品有效成分或指标性成分的含量，是评价2第一节化学分析法一、重量分析法基本原理：以质量为测定值的定量分析方法应用：挥发法萃取法沉淀法第一节化学分析法一、重量分析法3第一节化学分析法二、酸碱滴定法基本原理：以酸、碱中和反应为基础的滴定分析法应用：直接滴定法剩余滴定法第一节化学分析法二、酸碱滴定法4第一节化学分析法三、氧化还原滴定法基本原理：以氧化还原反应为基础的滴定分析法应用：碘量法溴量法铈量法亚硝酸钠法高锰酸钾法重铬酸钾法第一节化学分析法三、氧化还原滴定法5碘量法基本原理：以碘的氧化性或I-的还原性进行的氧化还原滴定分析法应用：直接碘量法间接碘量法测定范围：强氧化性和强还原性物质剩余碘量法置换碘量法碘量法基本原理：以碘的氧化性或I-的还原性进行的氧化还原滴定6溴量法基本原理：以溴的氧化作用和溴代作用为基础的滴定分析法溴：溴酸钾＋溴化钾应用：主要用来测定能和溴发生溴代反应或能被溴氧化的药物的含量溴量法基本原理：以溴的氧化作用和溴代作用为基础的滴定分析法7铈量法基本原理：以硫酸铈为滴定液的氧化还原滴定法指示剂：邻二氮菲应用：氧化性弱于高锰酸钾，《中国药典》用来测定硝苯地平、葡萄糖酸亚铁及其制剂、硫酸亚铁片的含量铈量法基本原理：以硫酸铈为滴定液的氧化还原滴定法8亚硝酸钠滴定法基本原理：利用亚硝酸钠在盐酸存在下可与具有芳香第一胺的化合物发生重氮化反应，定量生成重氮盐，根据滴定时消耗亚硝酸钠的量来计算药物含量的方法。应用：用来测定含有芳香第一胺或水解后能生成芳香第一胺的化合物指示终点：永停法亚硝酸钠滴定法基本原理：利用亚硝酸钠在盐酸存在下可与具有芳香9第一节化学分析法四、非水溶液滴定法基本原理：在非水溶剂中进行滴定的滴定分析方法。应用：碱量法酸量法第一节化学分析法四、非水溶液滴定法10第一节化学分析法五、沉淀法基本原理：以沉淀为基础的滴定分析法应用：用于无机卤化物以及能与Ag＋或SCN-形成沉淀的离子的测定。

银量法第一节化学分析法五、沉淀法11第一节化学分析法六、配位滴定法基本原理：以配位反应为基础的滴定分析法配位剂：乙二胺四乙酸（EDTA）应用：主要用于金属离子的测定第一节化学分析法六、配位滴定法12第二节紫外－可见分光光度法分光光度法——通过测定物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性定量分析。第二节紫外－可见分光光度法分光光度法13第二节紫外－可见分光光度法一、基本原理单色光辐射穿过被测物质溶液时，在一定的浓度范围内被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度成正比，即朗伯比尔定律第二节紫外－可见分光光度法一、基本原理14第二节紫外－可见分光光度法A＝lg1/T=ECL吸收系数E1%：当溶液浓度为1％（g/ml），液层厚度为1cm时的吸光度A：吸光度T：透光度C：100ml溶液中所含被测物质的重量（g）L：液层厚度（cm）1cm第二节紫外－可见分光光度法A＝lg1/T=ECL1cm15第二节紫外－可见分光光度法二、应用及注意事项有机化合物分子结构中含有共轭体系、芳香环等发色基团，均可在紫外（200～400nm）或可见光区（400～760nm）产生吸收，或在一定条件下加入显色剂或经处理显色后产生吸收第二节紫外－可见分光光度法二、应用及注意事项16第二节紫外－可见分光光度法二、应用及注意事项除另有规定的，应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照，采用1cm的石英吸收池供试品溶液的读数以在0.3～0.7之间的误差较小当pH有影响时，应将供试品和对照品的pH调成一致第二节紫外－可见分光光度法二、应用及注意事项17第二节紫外－可见分光光度法二、应用及注意事项对照品比较法吸收系数法计算分光光度法比色法第二节紫外－可见分光光度法二、应用及注意事项18第二节紫外－可见分光光度法仪器的校正和检定波长：汞灯，氘灯吸收度的准确度：可用重铬酸钾的硫酸溶液检定杂散光的检查：配成碘化钠或亚硝酸钠溶液，检查透光率第二节紫外－可见分光光度法仪器的校正和检定19第二节紫外－可见分光光度法对溶剂的要求在220～240nm范围内，吸收度不得超过0.40在241～250nm范围内，吸收度不得超过0.20在251～300nm范围内，吸收度不得超过0.10在300nm以上时不得吸收度超过0.05第二节紫外－可见分光光度法对溶剂的要求20第三节高效液相色谱第三节高效液相色谱21基本原理采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱分析方法。供试品经进样阀注入，由流动相带动通过色谱柱，各成分在柱内被分离后，依次通过检测器，其成分情况转变为其色谱信号情况，并由记录仪、积分仪或计算机记录、显示而作为检验成分的依据。基本原理采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有22对仪器的一般要求色谱柱常用的填充柱为化学键合硅胶，反相系统使用非极性填充剂，最为常用的是十八烷基键合硅胶；正相系统使用极性填充剂，常用的是硅胶检测器常用的为紫外检测器流动相反相：流动相中有机溶剂不低于5%对仪器的一般要求色谱柱23高效液相色谱的基本定性参数

1、保留时间（tR）2、死时间（t0）3、保留体积（VR）4、死体积（V0）高效液相色谱的基本定性参数1、保留时间（tR）245、柱效参数：a.区域宽度：在一定条件下，区域宽度越大（峰越胖），柱效越低。i)标准偏差：拐点处的峰宽之半。ii)半峰宽：色谱峰峰高一半处的峰宽。iii)峰宽：通过色谱峰两侧的拐点作切线在基线上所截的距离。

5、柱效参数：25b.理论塔板数和理论塔板高度：i)可由色谱峰的保留时间和区域宽度计算ii)理论塔板高度组分的保留时间越长，σ、Wh/2

、W越小，则理论塔板数越大，柱效越高。n=(tR/σ)2=5.54(tR/Wh/2)2H=σ2/Lb.理论塔板数和理论塔板高度：组分的保留时间26系统适用性试验

按药典各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度重复性和拖尾因子。系统适用性试验按药典各品种项下要求对仪器进行27（1）色谱柱的理论板数（n）：在选定的条件下，注入供试品溶液或药典各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主要成分或内标物质峰的保留时间tR和半峰宽，按n=5.54(tR/wA/2)2计算色谱柱的理论板数。如果测得理论板数低于药典各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。

（1）色谱柱的理论板数（n）：28

（2）

分离度：定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度，分离度R的计算公式为：R=2（tR2-tR1）/(w1+w2)式中tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间w1及w2为相邻两峰的峰宽分离度要求：大于1.5（2）

分离度：29（3）重复性取个品种项下的对照溶液，连续进样5次，峰面积测量值的相对标准偏差不大于2.0%也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%,100%和120%的对照溶液，加入规定量的内标溶液，配成三种不同浓度的溶液，分别注样至少2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于2.0%。（3）重复性30

（4）拖尾因子：为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子（T）是否符合药典各品种项下的规定或不同浓度进样的校正因子误差是否符合要求。拖尾因子计算公式为：T=w0.05h/2d1式中w0.05h为0.05峰高处的峰宽d1为峰极大至峰前沿之间的距离除另有规定外，T应在0.95-1.05间（4）拖尾因子：为保证测量精度，特别当采用峰高法测31定量分析HPLC定量分析的参数是色谱峰高和峰面积，定量依据是样品中组分的量与峰高或峰面积成正比。常用的定量方法有外标法、内标法和内加法。1、定量分析参数的选择：峰高，峰面积定量分析HPLC定量分析的参数是色谱峰高和峰322、外标法：用与待测组分同质的标准品作对照品，以对照品的量对比求算试样含量的方法。又可分为外标工作曲线法、外标一点法、外标二点法。在HPLC中，因进样量大，且用六通阀定量进样，误差相对较小，所以外标法是HPLC常用的定量分析方法。a.工作曲线法：用对照品配制系列浓度的对照品溶液，准确进样，测量峰面积或峰高，对浓度C绘制标准曲线，利用此曲线或它的回归方程式计算样品溶液的含量。2、外标法：33b.外标一点法：用一种浓度的对照品溶液对比求算样品含量的方法，只有在工作曲线通过原点，即截距为零时，才可用外标一点法进行定量分析。2、内标法：选择适宜的物质作为内标物，以待测组分和内标物的峰高比或峰面积比求算试样含量的方法。内标法的关键时选择合适的内标物。b.外标一点法：34

内标物的要求：1>内标物应是样品中不含有的物质2>纯度要高3>与待测组分有相似的理化性质，因而保留时间与待测组分接近4>与样品中各组分能完全分离且不与样品反应

内标法可分为工作曲线法、内标一点法、内标二点法及校正因子法等。

35使用内标的作用：可以抵消仪器稳定性差，进样量不够准确等原因带来的定量分析误差。如果在样品预处理前加入内标物，则可抵消方法全过程引起的误差。使用内标的作用：36

Ai/As=a+bCi将与对照品溶液中相同量的内标物加至样品溶液中，分别测量样品中I组分与内标物峰面积（或峰高），以两者峰面积或峰高之比代入回归方程式计算出样品中i组分的含量。a.工作曲线法：与外标法相似，只是在各种浓度的对照品溶液中加入相同量的内标物。分别测量I组分与内标物S的峰面积A（或峰高h)，以峰面积比Ai/As与Ci绘制工作曲线，或求出回归方程式。Ai/As=a+bCi37b.内标对比法：只配制一个浓度的对照品溶液，然后在样品与对照品溶液中加入相同量的内标物，分别进样。按下式计算样品浓度。与外标法相似，只有线性关系好且截距a为零时才可用内标一点法定量。(Ci)样＝（Ai/As）样（Ai/As）对xCi对照b.内标对比法：与外标法相似，只有线性关系38c.内标校正因子法：在HPLC分析中，等量的不同物质在相同实验条件下，在同一检测器上的响应值经常不同，为了校正这种响应的差别，引入了校正因子的概念。

f定义为：被测组分单位峰面积（或峰高）所相当物质的量与参比物质（内标物）单位峰面积（或峰高）所相当物质的量的比值。c.内标校正因子法：391）校正因子（f）=As/msAr/mr2）含量（mx)=fX

AxAs’/ms`1）校正因子（f）=As/msAr/mr240d.内加法：将待测组分i的纯品加至待测样品溶液中，测定增加纯品后的溶液比原样品溶液中i组分的峰面积增量，求算i组分的含量。此法不需要内标物，又能克服由于进样量不准确所带来的定量分析误差。mi=Ai/Ai*

mimi是纯物质i的加入量，Ai是相应增加的峰面积d.内加法：mi=Ai/Ai*41梯度洗脱

HPLC的色谱洗脱技术有等强度和梯度洗脱两种。等强度洗脱：在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱42梯度洗脱：在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等。分析组分数目多、性质相差较大的复杂样品时须采用梯度洗脱技术，使所有的组分都在适宜的条件下获得分离。优点：能缩短分析时间，提高分离度、改善峰形，提高检测灵敏度。缺点：常引起基线漂移和降低重现性。梯度洗脱：在一个分析周期内程序控制流动相43第四节气相色谱法采用气体为流动相（载气）流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。物质或其衍生物汽化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，用记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。第四节气相色谱法采用气体为流动相（载气）44对仪器的一般要求载气氦气、氮气和氢气进样直接进样和顶空进样色谱柱填充柱和毛细管柱检测器常用FID对仪器的一般要求载气45第五节分析方法的验证1、准确度（accuracy）指分析方法所得的测定结果与真实值或参考值接近的程度。一般以回收率表示。原料药可用已知纯度的对照品或供试品进行测定，也可以将验证方法的测定结果与另一已建立的准确可靠方法的测定结果进行对比来确定。制剂可用含已知量被测物的各组分混合物进行测定。至少用9个测定结果进行评价。

第五节分析方法的验证1、准确度（accuracy）462、精密度（precision）指在规定的测试条件下，同一均匀样