培养基无菌性试验

附件7.4测试内容：培养基无菌性试验目的和检查描述：本试验的目的是证明除菌过滤系统能够有效的过滤除去微生物，培养基模拟分装试验的结果受培养基无菌性的影响很大，若不能保证培养基在模拟分装试验前的无菌性，或培养基在分装前受到微生物污染，则不能保证试验结果的可信性，也很难成功地完成此项模拟试验。因此在粉针剂模拟分装试验之前进行培养基无菌性试验。在证明了培养基的无菌性之后进行模拟分装的方法，以排除培养基无菌性对此项验证试验的影响，从而确认模拟分装试验中的污染来源于分装过程。本次试验同时也是培养基无菌灌装验证之前的预试验。操作：培养基无菌性试验的主要方法是将一次除菌过滤后用于模拟分装的TSB培养基用灌装机分装于一定数量（400支）的无菌预充式注射器中，加塞封口，剩余的培养基分装在已灭菌的带棉塞的三角瓶中，连同灌装好的注射器一同在相应温度下培养7天，7天内各预充式注射器TSB培养基中应无任何微生物生长。本次验证所用预充式注射器为威高产3.0ml注射器（带胶塞），因该注射器与生产用（BG产）预充式注射器（带胶塞）的内径、高度、材质完全一致，为了降低验证成本，选用威高产3.0ml注射器作为本次试验用预充式注射器，培养微生物生长性能试验及今后的培养基无菌灌装工艺也用该注射器。按照培养基说明书的要求配制16LTSB培养基，按照《重组人血管内皮抑制素除菌过滤标准操作规程》（MF057）和《SartoriusSartopore2除菌过滤系统的标准操作规程》（MF191）的要求进行一次除菌过滤，带膜完整性检测合格后，把培养基移到灌装室的百级层流下进行二次除菌，灌装400支注射器，在灌装时按照灌装的顺序用1,2,3…….400进行依次标记于橡胶护帽上，灌装结束后，剩余的TSB培养基通过二次除菌过滤后分装在已经过灭菌的三角瓶（带棉塞、纱布和牛皮纸的）中，2个3L的三角瓶各装3L，两个2L三角瓶，每个装2L，一个1L三角瓶，装1L培养基（用于培养基的微生物生长性能试验用），过滤前取200ml培养基，采用薄膜过滤法，对培养基进行微生物含量检查，检查方法参照《微生物限度测定标准操作规程》（QC117）。除菌所用的Sartopore2SterileMidiCap型过滤器在灭菌前和过滤后按照《SartoriusSartocheck4膜完整性测试仪标准操作规程》（MF190）对其进行膜完整性检查（B.P>3.2bar）。应按以下文件进行检查：测试内容/项目检查附件是否可接受备注培养基配制及器具的灭菌7.4.1灌装环境的清洁、消毒效果检查及人员着装检查7.4.2TSB培养基无菌性试验7.4.3执行人：日期：复核人：日期：7.4.1培养基配制及器具的灭菌7.4.1.1培养基配制记录：培养基名称生产厂家批号配制方法胰酶酪豚大豆肉汤培养基 g干粉，加注射用 L，加热溶解操作人： 复核人： 日期:7.4.1.2除菌过滤前TSB培养基微生物限度检验检查依据：微生物检查参照《微生物限度测定标准操作规程》（QC117），采用薄膜过滤法.营养琼脂培养基的配制：称取营养琼脂培养基干粉（中检所监制，批号：） g，加纯化水ml加热溶解。检验用平皿的准备：准备直径90mm的带盖玻璃平皿 套，用牛皮纸包裹。灭菌：以上培养基和物品统一灭菌，灭菌条件：121°C,30min。操作人： 复核人： 日期：玫瑰红钠琼脂培养基的配制：称取玫瑰红钠琼脂培养基干粉（中检所生产，批号：）g，加纯化水ml，加热溶解。检验用平皿的准备：准备直径90mm的带盖玻璃平皿 套，用牛皮纸包裹。灭菌：以上培养基和物品统一灭菌，灭菌条件：121°C,30min。操作人： 复核人： 日期：Rodac碟培养基的的配制：称取胰酪豚大豆肉汤培养基干粉（上海中科，批号：） g，卵磷脂（国药集团，批号：）g，吐温80（批号：）9，加入纯化水ml,微温使其溶解，用1.0M的氢氧化钠调节pH值使灭菌后为7.3±0.2，加入琼脂g，加热使其溶解。灭菌：灭菌条件：121°C,30min。Rodac碟的批号：，生产厂商：，数量：。操作人： 复核人： 日期：取样用试管的准备：准备10ml试管支，内装2ml生理盐水和一根医用棉签，管口用医用纱布包裹的脱脂棉塞塞住，再用牛皮纸封口。灭菌：灭菌条件：121°C,30min。操作人： 复核人： 日期：7.4.1.3培养基除菌过滤前微生物含量检查结果:加样量（ml）营养琼脂平板菌落数（CFU/ml）玫瑰红钠琼脂平板菌落数（CFU/ml）总菌落数（CFU/ml）检查人： 复核人： 检查日期： 报告日期:7.4.1.4除菌过滤器的膜完整性检测一次除菌过滤器灭菌前膜完整性检测结果:滤器型号滤器编号滤膜孔径测试结果合格标准结果判定Sartorius0.22以m气泡点： 气泡点＞3200mbar符合规定口

Sartopore2操作人： 复核人： 日期:二次除菌过滤器灭菌前完整性检测结果:滤器型号滤器编号滤膜孔径测试结果合格标准结果判定SartoriusSartopore20.22pm气泡点： 气泡点＞3200mbar符合规定口操作人： 复核人： 日期:灭菌记录:灭菌项目灭菌工艺灭菌起止时间最终灭菌F0值结果判断灌装机配件121°C30min符合规定口无菌服121°C20min符合规定口备注操作人： 复核人： 日期:附灭菌的温度打印记录一次除菌过滤器过滤后完整性检测结果:滤器型号滤器编号滤膜孔径测试结果合格标准结果判定SartoriusSartopore20.22pm气泡点： 气泡点＞3200mbar符合规定口操作人： 复核人： 日期:二次除菌过滤器过滤后完整性检测结果：滤器型号滤器编号滤膜孔径测试结果合格标准结果判定SartoriusSartopore20.22pm气泡点： 气泡点＞3200mbar符合规定口操作人： 复核人： 日期:灌装人员数量和灌装性能检查结果:检查项目培养基灌装试验正常产品生产合格标准结果判定灌装速度35支/分钟以正常生产的速度灌装符合规定口压胶塞的真空度，Mpa0.092Mpa针筒内空气残留量应使针筒内的培养基的液面与胶塞的距离为3mm。符合规定口检查人： 复核人： 日期:7.4.2灌装环境的清洁、消毒效果检查及人员着装检查7.4.2.1操作人员微生物监控进入无菌区的人员按照《洁净区人员更衣标准操作规程》（MF149）进行更衣，操作结束后，按照《灌装无菌区人员更衣确认程序》（QA057）对操作者的左手、右手、口罩、胸口处、帽兜额头处、左臂、右臂等部位的微生物数量进行监测。测试方法：Rodac直接接触法：在室温下将待检表面直接贴在培养皿的培养基表面上，接触时间为1分钟。采样面积为25cm2或手套的5个手指。操作者必须戴手套，并消毒，避免产生污染。接触完毕后，盖上培养皿盖子，20~25°C培养72小时，统计菌落数量。参考《消毒效果检测标准操作规程》（QC195）。进入无菌区的人员（包括维修人员）必须经过更衣确认，否则，不得进入无菌区。7.4.2.2无菌区表面微生物检查灌装结束，按照《消毒效果检测标准操作规程》（QC195）对无菌区的内墙壁、门、设备及操作者可能接触的各种表面进行无菌程度检验。测试方法：棉签擦拭法取样法：灌装完成时，用事先经过灭菌的注射用水润湿的灭菌棉签充分擦拭，取样面积100cm2,然后将棉签上部减去，放入带塞的灭菌试管，加一定量（2ml）灭菌生理盐水振摇，微生物从棉签释放到生理盐水中，立即将生理盐水转入预先准备好的已灭菌的平皿中，然后加入擦拭取样培养基20毫升，冷凝后放置于30~35°C培养48小时。参考《消毒效果检测标准操作规程》（QC195）。7.4.2.3无菌区沉降菌检查在模拟灌装的过程中要对灌装室的环境进行沉降菌检查，每4个小时更换一次培养皿，30~35°C培养48小时。平均＜1CFU皿。灌装的过程中，要求有至少2个平皿应放在靠近灌装头的位置，该位置是灌装过程中的一个关键监控点。另外，在关闭空调前要更换沉降菌碟，以监测停空调时无菌万级区被污染的程度。7.4.2.4过滤人员及设备微生物检查结果（1）过滤人员微生物检查结果:序号检查部位取样方法菌落数（CFU/皿）合格标准（CFU/皿）结果判定1手套右手直接接触法<1符合规定口2手套左手直接接触法<1符合规定口3无菌服胸口直接接触法W1符合规定口4无菌服左臂直接接触法W1符合规定口5无菌服右臂直接接触法W1符合规定口6口罩直接接触法W3符合规定口7帽子额头直接接触法W1符合规定口被取样人员：检查人： 复核人： 检查日期： 报告日期:序号检查部位取样方法菌落数（CFU/皿）合格标准（CFU/皿）结果判定1手套右手直接接触法<1符合规定口2手套左手直接接触法<1符合规定口3无菌服胸口直接接触法W1符合规定口4无菌服左臂直接接触法W1符合规定口5无菌服右臂直接接触法W1符合规定口6口罩直接接触法W3符合规定口7帽子额头直接接触法W1符合规定口被取样人员：检查人： 复核人： 检查日期： 报告日期:序号检查部位取样方法菌落数（CFU/皿）合格标准（CFU/皿）结果判定1手套右手直接接触法<1符合规定口

2手套左手直接接触法<1符合规定口3无菌服胸口直接接触法W1符合规定口4无菌服左臂直接接触法W1符合规定口5无菌服右臂直接接触法W1符合规定口6口罩直接接触法W3符合规定口7帽子额头直接接触法W1符合规定口被取样人员：检查人： 复核人： 检查日期： 报告日期:(2)浙蜜装设备微生物检查结果序号检查部位取样方法菌落数（CFU/皿）合格标准（CFU/皿）结果判定1操作台面1棉签擦拭法W1符合规定口2操作台面2棉签擦拭法W1符合规定口3灌装机前门门把手棉签擦拭法<1符合规定口4灌装机后门门把手棉签擦拭法<1符合规定口5灌装针头棉签擦拭法<1符合规定口6垫圈棉签擦拭法<1符合规定口7料斗上部棉签擦拭法<1符合规定口8料斗底部棉签擦拭法<1符合规定口检查人： 复核人： 检查日期： 报告日期:7.4.2.5百级层流罩下沉降菌测定结果:暂存层流（房间号C341）平皿号1234菌落数（CFU/皿）平均菌落数（CFU/皿）合格标准（CFU/皿）W1CFU/皿 结果判定 符合规定口检查人： 复核人： 检查日期： 报告日期:灌装层流（房间号C342）平皿号7654321菌落数（CFU/皿）平皿号141312111098菌落数（CFU/皿）平皿号21201918171615菌落数（CFU/皿）平皿号28272625242322

菌落数（CFU/皿）平均菌落数（CFU/皿）合格标准（CFU/皿）W1CFU/皿结果判定符合规定口检查人： 复核人： 检查日期： 报告日期:无菌过滤层流（房间号C343）平皿号1234菌落数（CFU/皿）平均菌落数（CFU/皿）合格标准（CFU/皿）<1CFU/皿 结果判定 符合规定口检查人： 复核人： 检查日期： 报告日期:无菌洁具、消毒液暂存层流（房间号C344）平皿号1234菌落数（CFU/皿）平均菌落数（CFU/皿）合格标准（CFU/皿）<1CFU/皿 结果判定 符合规定口检查人： 复核人： 检查日期： 报告日期:灭菌后器具层流（房间号C345）平皿号12345678910菌落数（CFU/皿）平均菌落数（CFU/皿）合格标准（CFU/皿）W1CFU/皿 结果判定 符合规定口检查人： 复核人： 检查日期： 报告日期:7.4.2.6房间的沉降菌检测结果（除层流区以外）房间名称/房间编号平皿号/菌落数（CFU/皿）12平均合格标准结果判定无菌万级缓冲/C333平均W3符合规定口女更（一）/C334平均W3符合规定口女更（二）/C335平均W3符合规定口女更（三）/C336平均W3符合规定口男更（一）/C337平均W3符合规定口男更（二）/C338平均W3符合规定口男更（三）/C339平均W3符合规定口缓冲/C340平均W3符合规定口

一万级无菌走廊平均W3符合规定口一万级无菌走廊左平均W3符合规定口暂存/C341平均W3符合规定口灌装/C342平均W3符合规定口无菌过滤/C343平均W3符合规定口无菌洁具、消毒液暂存/C344平均W3符合规定口灭菌后器具/C345平均W3符合规定口传递/C346平均W3符合规定口检查人： 复核人： 检查日期： 报告日期:7.4.2.7其他部位擦拭取样检测结果序号检查部位取样方法菌落数（CFU/皿）合格标准（CFU/皿）结果判定1男三更后门把手棉签擦拭法W1符合规定口2缓冲后门把手棉签擦拭法W1符合规定口3进走廊左门把手棉签擦拭法W1符合规定口4进灌装室门把手棉签擦拭法W1符合规定口5灌装层流地面1棉签擦拭法W1符合规定口6灌装层流地面2棉签擦拭法W1符合规定口7灌装层流墙面1棉签擦拭法W1符合规定口8灌装层流墙面2棉签擦拭法W1符合规定口9灌装室地面1棉签擦拭法<5符合规定口10灌装室地面2棉签擦拭法<5符合规定口11灌装室墙面1棉签擦拭法W3符合规定口12灌装室墙面2棉签擦拭法W3符合规定口13暂存台面1棉签擦拭法W1符合规定口14暂存台面2棉签擦拭法W1符合规定口15注射器外包装1棉签擦拭法W1符合规定口16注射器外包装2棉签擦拭法W1符合规定口17注射器盒