重组DNA技术的基本工具 高二下学期生物人教版选择性必修3

第三章

基因工程常见的转基因植物基因工程1.定义：基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。变异类型（原理）：基因重组转基因技术、基因拼接技术2.基本过程：抗虫棉是如何培育出来的呢？提取抗虫基因棉花细胞

普通棉花

(无抗虫特征)(含抗虫基因)

转基因棉花(有抗虫特征)培育抗虫棉的基本过程

目的基因2.基本过程：苏云金杆菌(有抗虫特征)

受体细胞赋予生物新的遗传特性导入表达科技探索之路第三章

基因工程第1节

重组DNA技术的基本工具

番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？从社会中来转基因番木瓜培育的基本过程？基本过程：切割→拼接→导入→表达切割目的基因番木瓜细胞普通番木瓜

转基因番木瓜某生物导入（载体）表达拼接分子手术刀分子缝合线分子运输车一、限制性内切核酸酶---“分子手术刀”1.限制酶主要来源：限制酶2.如何理解“限制性”：主要是从原核生物中分离纯化出来的旁栏思考：限制酶是一种防御性工具，切割入侵的外源核酸，使之失效，以保证自身安全P74拓展应用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开作用部位

细菌本身DNA无特定的识别序列

细菌对自身特定序列修饰保护（甲基化）4.限制酶只是一种酶吗？其识别序列如何？一、限制性内切核酸酶---“分子手术刀”限制酶是一类酶限制酶有数千种：识别序列：3.如何理解“内切”：从中间切割DNA序列外切酶：从一端切割DNA序列大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成；少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。（回文序列）EcoRⅠ：SmaⅠ：5′3′5′3′EcoRⅠ中心轴线5′3′5′3′SamⅠ黏性末端平末端5.切割结果一、限制性内切核酸酶---“分子手术刀”(AATT)(1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割的A片段产生的DNA片段相连接，为什么？2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割，各限制酶的识别序列和切割位点如下：XbaⅠ因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端拓展应用黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端平末端同尾酶二、DNA连接酶——“分子缝合针”2.遵循原则：能够将两个DNA片段连接起来的酶1.定义：碱基互补配对原则3.种类：E.coliDNA连接酶；T4DNA连接酶类型来源功能相同点差别E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体作用位点：只能连接黏性末端都能连(平末端效率较低)3.种类：二、DNA连接酶---“分子缝合针”旁栏思考：DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？磷酸二酯键在DNA复制时，将单个核苷酸连接到DNA片段上，形成磷酸二酯键。DNA连接酶：DNA聚合酶：DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？能够将两个DNA片段连接起来，形成磷酸二酯键。不同点：共同点：DNA聚合酶连接的是单个脱氧核苷酸，需要模板；不需要模板；DNA连接酶连接的是DNA片段，都是催化磷酸二酯键形成的酶三、基因进入受体细胞的载体---“分子运输车”接受外源基因的细胞1.常用载体--质粒：质粒定义：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。质粒的本质质粒作为载体的优势：具有一个至多个限制酶切割位点进行自我复制便于重组DNA分子的鉴定和筛选标记基因2.载体需要具备的条件：

基因可插入其中：具有一个至多个限制酶切割位点；

复制的能力：能在受体细胞中复制并稳定保存；

带有特殊的标记基因：便于筛选和鉴定；对受体细胞无害（安全性）；易分离获得。三、基因进入受体细胞的载体---“分子运输车”真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。3.其他载体：噬菌体、动植物病毒等思考·讨论重组DNA分子：请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoR

I的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。1.剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。2.不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。DNA的粗提取与鉴定一、实验原理：1．提取DNA的原理2．鉴定DNA的原理DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。（分离提取DNA）（溶解提纯DNA）新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。二、材料用具1.选材：DNA的粗提取与鉴定思考：选材能否是：哺乳动物成熟的红细胞？2.试剂：①研磨液；②体积分数为95%的酒精；③2mol/L的NaCl溶液；④二苯胺试剂DNA含量较高称取洋葱，切碎，放入研钵，倒入研磨液，充分研磨。方法一：在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取上清液；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取上清液。方法二：直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，取上清液。2.去除杂质—1.研磨——目的：将细胞破裂，释放DNA三、方法步骤SDS(洗涤剂)：破坏细胞膜，使蛋白质变性，但不破坏DNADNA的粗提取与鉴定DNA在此在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液,静置2~3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。3.DNA的析出—方法一：用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；方法二：将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。析出DNA抑制核酸水解酶的活性，抑制DNA降解；易形成DNA沉淀析出DNA避免破坏DNADNA的粗提取与鉴定4．DNA的鉴定试管编号AB步骤1步骤2步骤3步骤4实验现象实验结论2mol/L的NaCl溶液2mol/L的NaCl溶液不进行任何处理加丝状物或沉淀加4mL二苯胺，混匀加4mL二苯胺，混匀沸水浴5min沸水浴5min溶液不变蓝色溶液逐渐变成蓝色实验组中含有DNADNA充分溶解后，再加入二苯胺颜色的深浅代表:DNA的粗提取与鉴定DNA含量的多少对照组实验组若用X和Y两种限制酶处理DNA片段，酶切后进行电泳分析（酶切图