csubvemispar产生酶的条件和培养基的生物制浆过程英文

csubvemispar产生酶的条件和培养基的生物制浆过程英文

cedrissubvermista是一种可选择性分解木素的白腐菌，通常用于生物砂浆的制备。为了评价在生物制浆过程中各种酶所起的作用,对C.subvermispora产生酶进行浸提并进行测定。在此研究中,通过使用一系列培养基,提取并测定在生物制浆过程中产生的酶。锰过氧化物酶(MnP)产量远远高于漆酶,这种现象是不易观察出来的。通过分析几种催化底物(如丁香醛连氮,邻联茴香胺和ABTS),进一步证实漆酶量很少。在缺乏外源MnCeriporiopsissubvermispora是一种可选择性降解木素的白腐菌,经常被用于生物制浆。尽管人们对此菌种在液态基质中产生的酶已作过详细的研究,但是,评价其在生物制浆流程条件下产生的酶却很少见报道。尽管在C.subvermispora菌中已检测到木素过氧化物酶(LiP)类似基团,但在浸泡后的培养基中却缺少LiP活性。在这些培养条件下,C.subvermispora产生的漆酶和锰过氧化物酶(MnP)同工酶,就像半纤维素酶和少量纤维素酶联合体那样缺少纤维二糖水解酶活性。另外,由于一些培养基(如葡萄糖和氮源)的加入,培养基包括木素纤维材料漆酶产品也受到激发活化。另一方面,生物制浆是一种由培养菌产生酶,酶吸附在木片上并作用的固态发酵过程。所产生的胞外酶包括水解酶和氧化酶。由于酶的吸附特性,进行这些酶的实验室提取和测定就受到了限制,就像在木材抽出物中的几种非蛋白质性杂质的存在影响酶的测定。可溶性芳香族化合物的出现和提取物的黄色至棕色特性,导致采用分光光度法酶分析不得不在420nm波长以上进行。此外,提取物中Mn在进一步的研究中,木材生物降解过程中产生酶的活力与对木材细胞壁成分作用效果有关。在固态培养基下,C.subvermispora产生酶的活力测定和定量提取研究将有助于进一步证实上述观点。在本文中,通过对菌种在不同培养基和培养条件下培养,然后从固态培养的木片中浸提粗酶,来测定产生酶的种类和活力,对该菌种产酶进行研究,研究中优化了从木片中回收酶的工艺,并采用了一些新的方法以避免以往测定中存在的问题。11.1c.sabpermispor固体培养基的接种C.subvermispora(Pilat)Gilbn.和Ryv.培养基由乌拉圭的M.Speranza教授提供,在4℃保存于20g/L的麦芽汁(OXOIDLtd.,英国)斜面培养基上。培养基组成:200mL液体培养基包括:马铃薯汁肉汤(24g/L)(DIFCO,USA),酵母浸出汁(7g/L)(OXOIDLtd.,英国),用20个培养皿(直径为8mm)进行C.subvermispor固态基质的接种。液体培养基在27℃下静止培养10d,过滤后的菌丝体用300mL无菌水洗涤。每次100mL,3次,每次洗15s。对木片接种采用菌丝体悬浮液接种。火炬松木片(2.5cm×1.5cm×0.2cm)取自28年树龄的木材。进行生物降解实验之前,将木片在水中浸泡16h,滤去水,然后将木片在111℃下灭菌15min。24h后再灭一次。在每个反应器装入200g(绝干)木片,然后接入20mg(绝干)菌丝体。接种之后,将菌丝体和木片混匀,在27℃下培养7d,15d,30d,60d和90d。在降解过程中,向反应器中通0.2μm的膜过滤的湿空气(2.3L/h)。1.2抽提酶的提取用50mmol/L醋酸钠缓冲液(pH值5.5)和吐温60(0.1g/L)浸泡木片,然后将酶提取出来。将反应器中的物质全转移到21厄伦美厄烧瓶中,并用500mL抽提液进行抽提。在(10±1)℃时,以120r/min进行4h的抽提,连续抽提5次。在第二次抽提后,木片在抽出溶液中以4℃浸泡过夜。浸提液用滤纸过滤得到原酶液。1.3木素过氧化物酶活性测定通过在培养基中添加(和不加)MnSO漆酶分析使用下列化学试剂:丁香醛连氮,ABTS[2,2’-联氮-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)]和邻联茴香胺(3,3’-二甲氧基联苯胺)。反应在3mL的试管中进行,试管中加有0.6mLpH值为5.0的200mmol/L磷酸钠/100mmol/L柠檬酸缓冲液,0.2mL水,1.0mL原酶液和0.2mL的1.0mmol/L培养基。测定丁香醛连氮、ABTS和邻联茴香胺分别在525nm,420nm和460nm处吸光度值随时间的变化。总酚氧化酶(过氧化物酶和漆酶)测试以丁香醛连氮为底物,测定方法与漆酶相同,但需将0.2mL水换成0.2mL的2mmol/LH锰过氧化物酶活性测定以苯酚红为底物。反应在30mL比色管中进行,比色管中装有2.5mLpH值为4.5的20mmol/L琥珀酸钠缓冲液,3.0mL的50mmol/L乳酸钠溶液,1.0mL的1.0mmol/LMnSO将天青B作为培养基分析木素过氧化物酶。反应在3mL试管中进行,试管内有:1.25mLpH值为4.5的50mmol/L酒石酸钠缓冲液,0.5mL原酶液,0.25mL的320μmol/L天青B和0.5mL的2mmol/LH原酶液的总纤维素酶活采用Mandels等人的方法,用Whatman1号滤纸测定。原酶液的纤维素酶活也通过处理在50mmol/L醋酸钠缓冲液(pH值5.0)中的纤维素悬浮液而得到。这种悬浮液(25mL)与2.5mL原酶液在40℃下以100r/min培养2～18h。在培养结束后,混合液用滤纸过滤。取出2.5mL放入-78℃冷藏室快速冷冻干燥。冻干料溶解于2mL的25mmol/LNaOH中后,用0.45μm的膜进行过滤,然后用2mL溶有海藻糖的水冲稀作为内标。此溶液用HPLC法分析葡萄糖、纤维二糖及纤维低聚物含量。根据Tenkanen等人的方法,使用DionexDX500系列色谱分析[带有脉冲电流计探测系统(DionexED40)]中的CarboPacPA-1柱图进行HPLC分析。如Bailey等人所述,木聚糖酶活性测定采用白桦木木聚糖为底物。用HPLC方法将木糖、木己糖和木质低聚物从木聚糖上分离。为了解决这个问题,用0.5mL原酶液处理2mL的10g/L木聚糖悬浮液(在50mmol/L醋酸钠缓冲液中,pH值5.5)。此混合物在37℃下培养5.25h。在培养结束后,将混合液放入-78℃冷藏室快速冷冻干燥。冻干料溶解于2mL的25mmol/LNaOH中后,用0.45μm的膜进行过滤,然后用2mL溶有海藻糖的水冲稀作为内标。使用与测定葡萄糖及纤维低聚物含量相同的流程来分析此溶液中木糖和木质低聚物含量。1.4酶液ph及酶活性测定在试验中,用0.25gPVP处理50mL酶液,在27℃下以120r/min反应1h。在处理后,酶液用滤纸过滤。用GBCCintra-20分光光度计可测定处理和未处理酶液的UV光谱。用Bradford方法确定PVP处理完酶液中的蛋白质含量。酶样也使用分离点为12kDa的膜,在4℃进行16h的分离。1.5浓硫酸盐水解木片研磨已生物处理完的木片过0.5mm筛。取6mL浓硫酸在DigesdahlHach蒸煮锅中水解已筛500mg木片,在440℃下加热5min。然后,加入3mL22.11纤维素水解酶活性测定用C.subvermispora在固态培养条件下处理火炬松木片,为了评价在生物制浆过程中各种酶所起的作用,对C.subvermispora产生酶进行浸提并进行测定。经过15d的生物处理后,木片上长出了菌丝体。随着培养时间的增长,菌丝体生长得更加密集。在90d的培养后,木片几乎全被菌丝体覆盖。用缓冲液抽提生物处理后的木片能得到在该菌生长过程中产生的胞外酶。使用丁香醛连氮作为底物分析氧化酶。提取物氧化丁香醛连氮取决于在反应基质中H当在培养基质中加入111μmol/LMnSO在没有外源Mn由于H从C.subvermispora培养基中得到的纤维素酶用滤纸法进行分析。用抽出液浸泡滤纸条发现糖减少的数量不大。此浓度在进行滤纸活性的测定时是不够高的。对纤维素水解酶的长期研究表明:在40℃下,培养已加入抽出液的纤维素悬浮液2～18h,发现存在很少聚合度为2～6(质量浓度低于4mg/L)的葡萄糖或纤维低聚物。事实上,Sethuraman等人证明在使用不同培养基的C.subvermispora振荡培养基中不能检测到纤维二糖水解酶活性。这些酶造成长纤维低聚物和纤维素中纤维二糖的减少,并由于β-葡(萄)糖苷酶的作用而进一步转化为葡萄糖。通过桦木木聚糖处理后酶数量的减少,进行抽出物的木聚糖溶解酶活性的分析。木聚糖酶标准是(303±33)IU/L抽出液,与培养基中的(778±92)IU/kg木片相对应。通过木聚糖水解后产品的特性进一步评价木聚糖溶解酶活性。聚合度为6～2的木质低聚物和木糖通过培养时间来定量(如图4所示)。在开始的15min反应时间内,木乙糖和其它低聚物随着培养时间的加长而增多,但木糖浓度是很低的。这个结果清楚地表明了抽出液中没有β-木糖苷酶活性。通过分析加入p-硝基苯基-β-D-木吡喃糖苷(MilagresA.的个人信息)的抽出液,也能证实没有β-木糖苷酶活性。2.2培养基中总mnp活性的测定关于产生的一部分胞外酶在生物降解过程中吸附于木质细胞壁上,对木片进行连续抽提来回收酶是有必要的。在原则上,对连续提取的抽出物中可溶蛋白质的质量浓度测定,来定义回收定量酶的抽出物数量。可是,在这些原酶液中蛋白质的测定是比较困难的,因为在提取流程中存在两个主要问题:(1)在每次抽提中使用的取决于木片体积的缓冲液的体积很小。在一个标准实验室摇瓶中,相对于200g木片的酶抽出液,为了覆盖所有木片需要缓冲液的体积很大(至少500mL),这样导致了蛋白质(酶)溶液的稀释;(2)抽出液中包含许多非蛋白质杂质(主要是木片抽出物和木素降解产物中的芳香化合物),它们通常能影响确定可溶蛋白质数量的常规Bradford或Biuret方法。经证实,使用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)从抽出液中除去芳香化合物是一种简单可行的方法,它能在不损失酶活的前提下得到纯的抽出物(适合用于Bradford法进行蛋白质测定)。用PVP处理导致在不损失MnP活性的前提下,使280nm处的吸光度减少80%。然而,在这些PVP提纯后的抽出物中的蛋白质质量浓度是很低的(例如,15d的培养基经过4h抽提后,蛋白质质量浓度为4.7μg/mL)。此蛋白质质量浓度和Bradford法检测极限相近。因此,只有抽出物质量浓度达到蛋白质测定质量浓度时,才能进行这些培养基酶抽出物的测定。作为一种选择条件,用MnP活性进行质量浓度测定定义连续抽提必需的数量,即用来从C.subvermispora培养7～90d的木片中定量回收酶所必需的数量(如图5所示)。当