Lecture十一基因芯片(DNAMicroarrays)

核酸与核酸反应核酸的组成：由很多单核苷酸组成的多聚物，核苷酸是由碱基、戊糖和磷酸构成；DNA二级结构、变性与复性：当温度上升，稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程；当温度回复正常值时，变性核酸的互补链重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。核酸分子杂交：应用核酸分子的变性和复性的性质，依据两条核酸单链在肯定条件下可按碱基互补原则退火形成双链的原理，用已知的单链核苷酸片段作为探针检测样本中是否存在与其互补的同源核酸序列的方法回顾回顾核酸适配体（aptamer）适配体：经体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段，可以是RNA也可以是DNA，长度一般为25~60个核苷酸核酸适配体与靶分子结合特点：通过自适应的构象变化和三维折叠形成特异性结合位点适配体筛选技术：利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其随机序列长度在20～100个碱基左右。将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留结合的寡核苷酸配基(aptamer)，经反复扩增、筛选数个循环，即可使与该靶分子特异结合的寡核苷酸序列得到富集。优点：体外筛选、分子较小、易人工合成、亲和力高、特异性强、靶分子范围广、可反复变性、复性缺点：DNA对核酸酶水解格外敏感回顾生物传感器第十一章基因芯片(DNAMicroarrays)内容提要生物芯片基本概念基因芯片的载体基因芯片的探针样本制备杂交信号检测结果分析讨论现状应用进展方向芯片分析的实质是在面积不大的基片（玻璃片、硅片、尼龙膜等材料）表面上有序地点阵排列了一系列固定于肯定位置的可寻址的识别分子，反应结果用同位素、荧光法、化学发光法等显示，然后用精密的扫描仪或CCD摄像技术记录，通过计算机分析，综合成可读的IC总信息。11.1基本概念Bio-CPUSamplesInformation芯片分析实际上也是传感分析的组合，芯片点阵中的每一个单元微点都是一个传感探头。传感技术进展的精髓往往都被应用于生物芯片的进展。阵列检测可以大大提高检测的效率，削减工作量，增加可比性。11.1基本概念芯片的分类：依据用途还可以把生物芯片分为两类：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）11.1基本概念基因芯片分类：依据探针的类型和长度，基因芯片可分为两类。其中一类是较长的DNA探针（>100mer）芯片，这类芯片的探针往往是PCR的产物，通过点样方法将探针固定在芯片上，主要用于RNA的表达分析。另一类是短的寡核苷酸探针芯片，其探针长度为25mer左右，一般通过在片（原位）合成方法得到，这类芯片既可用于RNA的表达监控，也可以用于核酸序列分析。11.1基本概念基因芯片：是通过微阵列技术,将高密度DNA片段阵列通过机器或原位合成方式以肯定的挨次或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面讨论的最新革命性技术。11.1基本概念工作原理：与经典的核酸分子杂交方法是全都的，都是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析，能够在同一时间内平行分析大量的基因，进行大信息量的筛选与检测分析。微阵列技术巨大优势在于它可以并行地宏量猎取生物信息，借助此技术进展的生物芯片则供应了以核酸杂交为基础的基因水平的表达监控，多态性讨论和基因分型(genotyping)，从而使我们对基因表达调控有更深化的了解。11.1基本概念基因芯片的优点高度并行性：提高实验进程、利于显示图谱的快速对比和阅读，在短短的几十分钟至数小时内，就可以完成用传统方法需要数月才能完成的几万乃至几十万次杂交分析试验。多样性：可进行样品的多方面分析，提高精确性，削减误差。微型化：削减试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速率。自动化：降低成本，保证质量。基因芯片的缺点在同一温度下杂交，不同探针杂交效率不同11.1基本概念芯片测定过程基本步骤11.1基本概念11.1基本概念载体：用于连接、吸附或包埋各种生物分子使其以水不溶性状态行使功能的固相材料统称为载体载体表面必须有可以进行化学反应的活性基团，以便与生物分子进行偶联单位载体上结合的生物分子达到最佳容量载体应当是惰性的和有足够的稳定性，包括机械的、物理的和化学稳定性惰性：载体不干扰生物分子功能稳定性：在压力或酸、碱条件下而不发生变化载体具有良好的生物相容性通常要有良好的光学性质，能适应投射或反射光的测量11.2基因芯片的载体适用于制作生物芯片的载体材料较少，通常使用玻璃片、金属片和有机高分子膜等来源便利，表面羟基容易活化，然后能偶联DNA、酶、抗体、蛋白质、多肽等大多数生物芯片采纳发光检测的方法，不管投射光还是反射光都适合11.2基因芯片的载体载体活化：通过化学反应用各种不同的活化试剂在载体表面键合上活性基团，以便与配基共价结合，形成具有不同的生物特异性的亲和载体，用来固定生物活性分子。11.2基因芯片的载体探针的设计：如何选择芯片上的探针确定芯片所要检测的目标对象查询生物分子数据库——取得相应的DNA序列数据序列对比分析——找出特征序列，作为芯片设计的参照序列。数据库搜寻——得到关于序列突变的信息及其它信息。cDNA芯片设计的关键在于数据库的建立和数据库信息的利用以及各种文库的建立11.3基因芯片的探针MousecDNALibrary~22,500knowngenes&ESTs(NIA)LeukocytecDNAlibrary~6,000ESTs(ACGT,CityU)CarpFishcDNAlibrary~6,500ESTs(ACGT,CityU)HumancDNALibrary~10,000knowngenes&ESTs(Incyte,Inc)在进行探针设计和布局时必须考虑：互补性、敏感性和特异性、容错性、牢靠性、可控性、可读性对于DNA序列变异分析，最基本的要求是能够检测动身生变异的位置，进一步的要求是能够发现发生了什么样的变化。从杂交的单碱基错配辨别能力来看，当错配消灭在探针中心时，辨别能力强，而当错配消灭在探针两端时，辨别能力格外弱。所以，在设计检测DNA序列变异的探针时，检测变化点应该对应于探针的中心，以得到最大的分辨率。11.3基因芯片的探针11.3基因芯片的探针原位合成直接点样原位光蚀刻合成原位喷印合成

分子印章法针式点样喷墨点样光导原位合成法

基因芯片的制作方式光刻DNA合成法：由Affymetrix公司开发的，采纳的技术原理是在合成碱基单体的5‘羟基末端连上一个光敏保护基。合成的第一步是利用光照耀使羟基端脱保护，然后一个5’端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。11.3.1光刻合成法使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。某一含n个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4×n个化学步骤能合成出4n个可能结构。例如：一个完整的十核苷酸通过32个化学步骤，8个小时可能合成65,536个探针。合成的密度和精度高，能在1.6cm2的面积内点40万个cDNA目前美国Affymetrix公司已有同时检测6,500个已知人类基因的DNA芯片，该产品不仅可用于基因表达分析和基因诊断等，而且在大规模药物开发方面也具有诱人的前景光刻设备技术简洁，只能有专业化公司生产，需要花费大量的时间去设计和制造价格很高的光掩模，成本高及合成效率低11.3.1光刻合成法是在经过处理的载玻片表面铺上一层连接分子（linker），其羟基上加有光敏保护基团，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithographicmask）保护不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羟基上的保护基团。11.3.2光导原位合成法游离羟基利用化学反应加上第一个核苷酸，所加核苷酸种类及在芯片上的部位预先设定，所引入的核苷酸带有光敏保护基团，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位点加上另外三种核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而N个核苷酸长的芯片需要4N个步骤。芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动并依据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。该技术采纳的化学原理与传统的DNA固相合成全都，因此不特殊制备的化学试剂。11.3.3原位喷印合成法点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。点样分子可以是核酸也可以是寡核酸。采纳人工点样的方法将寡核苷酸分子点样于化学处理后的载玻片上，经肯定的化学方法处理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于载玻片上，制备好的DNA芯片可置于缓冲液中保存。11.3.4点样法点接触法优点：实验样机容易设计制作，是一种快速、经济、多功能的仪器，可以在3.6cm2的面积内点10000个cDNA；具有更强的亲和性和特异性杂交缺点：每个样品必须是合成好的、经过纯化的、事先保存的11.3.4点样法喷墨法：以定滴供应的方式，通过压电晶体或其他推动形式从最小的喷嘴内把生物样品喷射到载体上可以在1cm2的面积内点10000个点，每个样品必须是合成好的、经过纯化的、事先保存的与点接触法的差别在于喷嘴不与芯片接触11.3.4点样法用多聚赖氨酸包被固相支待物玻片，经过分区后用计算机掌握的微阵列点样机依据预先设计挨次点上核酸分子，点样量很小，约为5nl，大规模cDNA芯片多采纳这种方法。11.3.4点样法末端标记：在引物上标记有荧光素，在DNA扩增过程时，使新形成的DNA链末端带有荧光素。随机插入：选择四种缄机基，使其中一种或几种挂有荧光素，在PCR过程中，带有荧光素的碱基和不带荧光探针的碱基，同时参加DNA链的形成。11.4样本制备制备高质量样本是困难的但又是极其重要的，用于基因类型分析的样本是DNA，用于表达讨论的样本是cDNA。样本制备后应进行标记，通常为酶标记、荧光标记和核素标记。最常用标记物为荧光素。是芯片技术中除方阵构建外最重要的一步液相中探针与DNA片段按碱基配对规章形成双链反应。待分析基因在与芯片结合探针杂交之前必需进行分离、扩增及标记。依据样品来源、基因含量及检测方法和分析目的不同，采纳的基因分离、扩增及标记方法各异。高度集成的微型样品处理系统如细胞分离芯片及基因扩增芯片等是实现上述目的的有效手段和进展方向。合适长度的DNA有利于与探针杂交，最好在封闭循环条件下杂交，杂交炉11.5杂交是芯片技术中除方阵构建外最重要的一步杂交条件的选择与讨论目的有关，多态性分析或者基因测序时，每个核苷酸或突变位点都必须检测出来，选择杂交条件时，必须满意检测时的灵敏度和特异性。使能检测到低丰度基因，且能保证每条探针都能与互补模板杂交。通常设计出一套四种寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每个位点，只在中央位点碱基有所不同，依据每套探针在某一特点位点的杂交严谨程度，即可测定出该碱基的种类。如果芯片仅用于检测基因表达，只需设计出针对基因中的特定区域的几套寡聚核苷酸即可表达检测需要长的杂交时间，更高的严谨性，更高的样品浓度和低温度，这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度。突变检测，要鉴别出单碱基错配，需要更高的杂交严谨性和更短的时间。11.5杂交由于完全正常的Watson-Crick配对双链要比具有错配(mismatch)碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性，所以，前者的荧光强度要比后者强出5-35%。该检测方法是具有肯定特异性的，而且荧光信号的强度还与样品中靶分子含量呈肯定的线性关系。由于DNA芯片本身的结构及性质，需要确定杂交信号在芯片上的位置，尤其是大规模DNA芯片由于其面积小，密度大，点样量很少，所以杂交信号较弱，需要使用光电倍增管或冷却的电荷偶连照相机(charged-coupleddevicecamera，CCD)摄像机等弱光信号探测装置。大多数DNA芯片杂交信号谱型除了分布位点以外还需要确定每一点上的信号强度，以确定是完全杂交还是不完全杂交，因而探测方法的灵敏度及线性响应也是格外重要的。杂交信号探测系统主要包括杂交信号产生、信号收集及传输和信号处理及成像三个部分组成。11.6信号检测激光扫描荧光显微镜：将杂交后的芯片经处理后固定在计算机掌握的二维传动平台上，并将一物镜置于其上方，由氩离子激光器产生激发光经滤波后通过物镜聚焦到芯片表面，激发荧光标记物产生荧光，光斑半径约为5－10μm。同时通过同一物镜收集荧光信号经另一滤波片滤波后，由冷却的光电倍增管探测，经模数转换板转换为数字信号。通过计算机掌握传动平台X－Y方向上步进平移，DNA芯片被逐点照耀，所采集荧光信号构成杂交信号谱型，送计算机分析处理，最后形成20μm象素的图像。分辨率高、图像质量较好，适用于各种主要类型的DNA芯片及大规模DNA芯片杂交信号检测，广泛应用于基因表达、基因诊断等方面讨论；但灵敏度较低11.6信号检测激光扫描共聚焦显微镜：激光扫描共聚焦显微镜与激光扫描荧光显微镜结构格外相像，但是由于采纳了共聚焦技术因而更具优越性。这种方法可以在荧光标记分子与DNA芯片杂交的同时进行杂交信号的探测，而无须清洗掉未杂交分子，从而简化了操作步骤大大提高了工作效率。通过计算机掌握激光束或样品池的移动，便可实现对芯片的二维扫描，移动步长与芯片上寡核苷酸的间距匹配，在几分钟至几十分钟内即可获得荧光标记杂交信号图谱。灵敏度和分辨率较高，扫描时间长，比较适合讨论用。11.6信号检测采纳了CCD相机的荧光显微镜：这种探测装置与以上的扫描方法都是基于荧光显微镜，但是以CCD相机作为信号接收器而不是光电倍增管，因而无须扫描传动平台。由于采纳了CCD相机，因而大大提高了猎取荧光图像的速度，曝光时间可缩短至零点几秒至十几秒。扫描时间短，灵敏度和分辨率较低，比较适合临床诊断用光纤传感器将DNA芯片直接做在光纤维束的切面上（远端），光纤维束的另一端（近端）经特制的耦合装置耦合到荧光显微镜中。化学方法合成的寡核苷酸探针共价结合于每根光纤的远端组成寡核苷酸阵列。将光纤远端浸入到荧光标记的靶分子溶液中与靶分子杂交，通过光纤维束传导来自荧光显微镜的激光（490urn），激发荧光标记物产生荧光，仍用光纤维束传导荧光信号返回到荧光显微镜，由CCD相机接收。快速、便捷，可实时检测DNA微阵列杂交情况而且具有较高的灵敏度，但由于光纤维束所含光纤数目有限，因而不便于制备大规模DNA芯片，有肯定的应用局限性11.6信号检测芯片扫读装置依据采纳的光电偶合器件，分为光电倍增管型和CCD型。依据激光光源，可分为激光型和非激光型。应用最为广泛的是激光光源的共聚焦扫描装置，分辨率、灵敏度极高，有良好的定位功能，可定量，应用广泛。11.6信号检测GenearrayTM扫描仪：激光：氩离子,488nm适用染料：荧光素、藻红素单扫描时间：<4分钟分辨率：3、6、9或24微米图像分析：样品与探针的错配是影响杂交反应结果的重要因素，但由于样品与芯片上的探针正确配对时产生的荧光信号要比错配时强的多，因此，通过对信号强度的分析，就可以区分正确与错误的配对。简洁的杂交图谱一般需由图象分析软件来完成，图象处理软件必须具备提取基因库和数据库的能力。11.7结果分析分析软件的功能：鉴定每个点阵、最大限度消除本底荧光的干扰、解析多种颜色图象、可标记或排解假阳性、识别和分析对比实验是否成功、可将信号标准化等。Step1-样点的识别：先确定样点的也许位置，再对网格定位Step2-背景的确定：芯片图像中各样点的信号值包括样品的真正信号和背景值，在提取样点信号前必须扣除背景。Step3-样点信号的确定：将套住样点圆内个像素信号值减去背景值，常用表示方式有中值、平均值、总信号值等方式Step4-归一化：“看家基因”法、总值归一法、中值归一法等看家基因是一个通用基因或DNA片段，其在几个不同实验中的表达极少受其他因素的转变而基本保持全都。看家基因作为阳性对比，将全部样点的校正信号值除以看家基因点的校正信号值，从而达到归一化的目的。11.7结果分析Step5-结果的显示：归一化后即可求双色荧光芯片图像的比例信息。基因表达讨论中比例信息代表了两个不用样品表达mRNA的水平。结果常用图形显示，包括伪彩色比例图、散点图等。11.7结果分析伪彩色比例图：依据生物芯片不同颜色荧光染料，用相应的颜色来表示该荧光图象，亮度表示样点的归一化校正信号，样点的信号越强则颜色越亮，两种颜色显示重叠在一起就产生很多种颜色，表示该样点表达的情况。对比样品用绿色染料Cy3标记，试验样品用红色染料Cy5标记，比例图像中不同亮度的两种颜色叠加就可以产生绿-橙-红的色度变化，绿色表示对比样品mRNA完全表达而试验样品mRNA未表达，红色表示对比样品mRNA未表达而试验样品mRNA完全表达。11.7结果分析散点图：横坐标表示对比样品如Cy3标记的样品样点的归一化校正信号值或其对数，纵坐标表示试验样品如Cy5标记的样品样点的归一化校正信号值或其对数若两个样品的表达程度全都，则散点集中在通过原点的斜率为1的直线四周；若两个样品的表达程度不全都，则散点会偏离45度线ratio>2.0(up-regulated);ratio<0.5(down-regulated)ratio>2.0Ratio<0.5Step6-结果有效性的证实在表达矩阵上，有时难于区分极其相像的序列，如基因族成员，亚类或异类的存在。比较两种不同DNA序列表达水平常，有些参数如核苷酸的成分、二级结构的存在和矩阵上DNA的长度都会影响杂交。证实矩阵分析的结果可用RT-PCR(区分基因族成员,比较不同DNA种系表达,证实基因变异或突变和精确测定DNA表达水平)、NorthernBlot(证实某一基因的相对表达水平)、WesternBlot(RNA表达是否达到细胞中的蛋白水平)、质谱仪(证实矩阵结果是否在蛋白水平)等。11.7结果分析数据处理：从生物芯片的图像分析中取得了大量的数据，这些数据是难以理解的，必须用专门的软件从中提取有用信息。常用的处理方法主要是聚类分析，包括系统聚类分析(hierarchicalclustering)和逐步聚类分析(K-Meansclustering)11.7结果分析系统聚类分析是将芯片表达的数据点安排进入有严格等级的层层嵌套的子集，最相接近的数据点分成一簇，并用一个新点来替换，该新点的值为此两点的平均值，其他点同样处理，然后用同样的方法进行下级处理，直至最终成为一个点，这样数据就形成一个家谱的树状结构，树枝的长度表示两簇数据的相像程度。系统聚类分析适合于具有真正等级下传的数据结构，不适合于基因表达谱可能相像的简洁数据集11.7结果分析逐步聚类分析是按用户输入的k值将数据集随机的分成k簇，然后(a)计算每簇的平均值，(b)随机选择一个数据点，将此数据点加入平均值与该点值最接近的簇，重新计算簇的平均值，重复上述2个步骤直至没有数据转变簇时，计算结束。每次迭代过程中簇的转变使簇内的变异最小，簇间的变异最大，这样使簇不断地改进，使得组间差异达到最大值逐步聚类分析适合于分类相像基因11.8基因芯片讨论现状现在全世界已有十多家公司专门从事基因芯片的讨论和开发工作，而且已有较为成型的产品和设备问世。这些公司主要以美国的Affymetrix公司为代表，产品已有部分投放市场，产生的社会效益和经济效益令人瞩目。用生物芯片进行药理遗传学和药理基因组学讨论所涉及的世界药物市场每年约1800亿美元。2010年仅美国用于基因组讨论的芯片销售额达400亿美元，这还不包括用于疾病预防及诊断及其他领域中的基因芯片。11.8基因芯片讨论现状11.8基因芯片讨论现状11.8基因芯片讨论现状我国生物芯片讨论始于1997年，在上海和北京建立了2个生物芯片国家工程讨论中心。目前，我国已有500余种生物芯片及相关产品问世。多个芯片产品获得了不同形式的新药及医疗器械证书，10余个芯片产品实现产业化生产，2005年实现销售额近2.5亿元，部分产品已经进入国际市场。我国生物芯片企业不少于50家，70-80%的生物芯片还只是用于研发，离完全商业化还有一段不短的距离。由于研发成本高，产品价格也较高。11.8基因芯片讨论现状11.9基因芯片应用基因功能分析讨论检测与疾病相关的基因,进而用于疾病诊断药物筛选

检测基因突变其他(环境化学毒物的筛选\体质医学的讨论)11.9基因芯片应用基因功能分析讨论将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在一块芯片上，对来源于不同个体不同组织不同细胞周期不同发育阶段不同分化阶段不同病变不同刺激（包括不同诱导不同治疗手段）下细胞内的mRNA或逆转录所得的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性组织特异性发育阶段特异性分化阶段特异性。进行综合评定与推断，极大加快这些基因功能的确立。检测与疾病相关的基因，进而用于疾病诊断。目前主要涉及：癌症心血管疾病血液病遗传性疾病神经系统疾病部分感染性疾病免疫反应相关性疾病毒物引起的损伤等11.9基因芯片应用11.9基因芯