合成冬虫夏草诱发沙门氏菌基因突变的ames试验研究

合成冬虫夏草诱发沙门氏菌基因突变的ames试验研究

婆罗洲的起源有两种类型：天然婆罗洲和合成婆罗洲。天然冰片多为龙脑香科植物龙脑香树脂的加工结晶品;合成冰片,是以樟脑、松节油为主要原料,经化学方法合成的精制品,又名机片。合成冰片除含有龙脑外,还含有大量龙脑的差向异构体———异龙脑1材料和方法1.1材料表面1.1.1细粉末制备工艺合成冰片由天津天士力制药股份有限公司提供,批号:20010923,试验前将合成冰片研磨成细粉末,过140目筛,临用前用二甲基亚砜(DMSO)配制成不同浓度受试液。1.1.2羟基1,8-a敌克松(Dexon);二氨基芴(2-AF);1,8-二羟基蒽醌(1,8-Dan),来源:美国Sigma公司,用DMSO配制,2～8℃保存,所有接触阳性对照剂的试验物品,如平皿、试管等均用专用塑料袋封装,按同位素垃圾处理方式处理1.1.3s9代谢激活系统的制备肝脏微粒体酶(S9)活化系统的制备依照Ames法1.1.4tal00和taol2ce的构建采用组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TAl00和TAl02共4株标准菌株(由北京军事医学科学院毒理研究所惠赠)。试验菌株遗传特性(组氨酸需求、rfa突变、紫外线敏感、氨苄青霉素抗性、四环素抗性)经鉴定均符合试验要求。1.1.5两组氨酸、生物素的含量顶层培养基:0.6%纯琼脂,含0.5%NaCl,0.05mol/L组氨酸或生物素。底层培养基:1.5%琼脂水溶液,含2%葡萄糖和10倍Vogel-Bonner培养基(V-B储存液),每500mL琼脂水溶液中10倍V-B储存液占100mL。1.2方法1.2.1梯度稀释使受试物作用将合成冰片以DMSO配制成10g/L的母液,梯度稀释使受试物作用于TA98和TAl00测试菌株的终浓度为1000、500、250μg/皿。每测试浓度在活化和非活化条件下各做3个平皿。1.2.2物的诱导诱导试验同时设溶剂对照组(+/-S9mix)、空白(即自发回变)对照组(+/-S9mix),以及阳性诱变剂对照组,阳性物包括直接诱变剂敌克松(50.0μg/皿)———在无S9活化系统时作用于4株菌,间接诱变剂2-氨基芴(20.0μg/皿)———在有S9活化系统时作用于TA97、TA98、TAl00,间接诱变剂1,8-二羟基蒽醌(50.0μg/皿)———在有S9活化系统时作用于TAl02。共进行3批试验,每批试验每1浓度测试点在活化和非活化条件下各做两个平行平皿。计算3批试验的平均值。1.2.4回复突变菌落数测定按《新药(中药)临床前研究指导原则》,如在1个或1个以上测试浓度诱发的回复突变菌落数比溶剂对照增加1倍以上,且具有剂量依赖关系,可判为阳性反应。任何菌株出现上述阳性反应时,均可判为试验结果阳性。2结果2.1合成晶片检测用TA98、TA100作为测试菌株进行的预试验结果显示,在1000μg/皿以上受试浓度下,当将合成冰片加入试验系统时出现不同程度的白色析出,并且合成冰片在500μg/皿以上测试浓度下出现抑菌作用,据此,将受试物的最大测试浓度定为250μg/皿,按等比递减原则,将诱变试验中合成冰片受试浓度设置为250,50,10,2和0.4μg/皿。2.2鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验结果经过48h的培养后,各剂量组的标准测试株菌苔生长情况良好。结果见表1。由表1可见,各试验菌株自发回变率均在正常范围,各菌株对相应的诊断性诱变剂均获得明确的阳性反应,说明试验系统可靠。合成冰片250、50、10、2和0.4μg/皿各剂量组,无论在加与不加S9活化系统条件下,对鼠伤寒沙门氏组氨酸合成缺陷菌株TA97、TA98、TAl00和TAl02回复突变的菌落数均在正常范围内,与溶剂(DMSO)对照相比均无明显增加,即均未超过溶剂对照的两倍。可认为合成冰片对4株标准测试菌株均未显示致突变性,Ames试验结果阴性。3合成热法药物的安全性Ames试验是1975年由美国加州大学生物化学教授AmesB.N.首次完整提出的突变(mutation)是指微生物基因组的核酸序列发生可遗传的改变本试验中,在加与不加S9活化系统的两种条件下,合成冰片在0.4～250μg/皿浓度范围内对TA97、TA98、TAl00和TAl02均未体现出诱发回变菌落数增加作用,合成冰片在Ames试验中无致突变作用