基因工程药物的分离纯化

基因工程药物的分离纯化基因工程药物的分离纯化第1页②含有大量细胞及代谢产物；③表示产物稳定性差，易失活变性；④表示产物种类繁多、结构不一、活性各异；⑤对其质量要求纯度高、无菌、无热原。基因工程药物的分离纯化第2页一、建立分离纯化工艺依据⒈含目标产物起始料特点基因工程菌发酵产物其上游过程各种原因对分离、纯化工艺有影响。包含：①菌种类型及其代谢特征。②原材料培养基起源及其质量。③生产工艺及条件。基因工程药物的分离纯化第3页⒉物料中杂质种类和性质。⒊目标产物特征。⒋产品质量要求基因工程药物的分离纯化第4页二、分离纯化基础过程

发酵液细胞分离胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离浓缩初步分离高度纯化制剂产品包含体细胞碎片分离变性复性基因工程药物的分离纯化第5页三、分离纯化技术分离纯化技术要求：①技术条件温和能保持产物生物活性。②选择性好，能从复杂混合物中有效将目标产物分离，到达较高纯化倍数。

基因工程药物的分离纯化第6页③收率要高。④两个技数间能直接衔接，不需要对物料加以处理。⑤纯化过程要快，满足高生产率要求。基因工程药物的分离纯化第7页⒈细胞破碎与固液分离

⑴细胞搜集：离心法、膜分离法。⑵细胞破碎：机械破碎法、非机械破碎法。⑶固液分离基因工程药物的分离纯化第8页⒉目标产物分离纯化

目标产物含有大量杂质必须进行分离纯化。蛋白质分离纯化方法设计依据其分子理化性质和生物学特征来决定。

产物特性作用

等电点决定离子交换种类及条件相对分子量选择不一样孔径介质疏水性与疏水、反相介质结合程度生物特异性决定亲和配基溶解性决定分离体系及蛋白浓度稳定性决定工艺采取温度及流程时间基因工程药物的分离纯化第9页⒉目标产物分离纯化

目标产物含有大量杂质必须进行分离纯化。蛋白质分离纯化方法设计依据其分子理化性质和生物学特征来决定。基因工程药物的分离纯化第10页

产物特性作用等电点决定离子交换种类及条件相对分子量选择不一样孔径介质疏水性与疏水、反相介质结合程度生物特异性决定亲和配基溶解性决定分离体系及蛋白浓度稳定性决定工艺采取温度及流程时间

产物特征在分离纯化中作用基因工程药物的分离纯化第11页分离纯化方法依赖色谱分离方法

⑴离子交换层析（ionexchangechromatographyIEC）离子交换层析基础原理是经过带电溶质分子与离子交换剂中可交换离子进行交换，从而到达分离目标。它含有分辨率高容量大操作轻易，该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化主要方法。

基因工程药物的分离纯化第12页⑵反相色谱（reversedphasechromatography，RPC）和

疏水色谱（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）

反相色谱和疏水色谱是依据蛋白质疏水性差异来分离纯化。反相色谱是利用溶质分子中非极性基团与非极性固定相之间相互作用力大小以及溶质分子中极性基团与流动相中极性分子之间在相反方向作用力大小差异进行分离。基因工程药物的分离纯化第13页

常见固定相为硅胶烷基键合相。流动相为低离子强度酸性水溶液，加入能与水互溶乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂。因为固定相骨架疏水性强，吸附蛋白质需用有机溶剂才能洗脱下来。基因工程药物的分离纯化第14页

疏水色谱原理与反相色谱原理相同，主要是利用蛋白质分子表面上疏水区域和介质中疏水基团之间相互作用，无机盐存在能使相互作用力增强。固定相介质表面疏水性比反相色谱介质表面疏水性弱。为有机聚合物键合相或大孔硅胶键合相。流动相为pH6～8盐水溶液。基因工程药物的分离纯化第15页

在高盐浓度时，蛋白质分子中疏水性个别与介子疏水基团产生疏水性作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白质疏水性作用减弱，目标蛋白质被逐步洗脱下来，蛋白质疏水性越强，洗脱时间越长。与反相色谱相比，疏水色谱回收率较高，蛋白质变性可能性小。基因工程药物的分离纯化第16页⑶亲和层析（affinitychromatography，AC）

亲和层析是利用固定化配基与目标蛋白质之间特异生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间作用。基因工程药物的分离纯化第17页

配基：在亲和层析中起可逆性结合特异性物质。载体：与配基结合支撑物。

亲和层析大致可分三步：①配基固定化②吸附目标物③样品解吸基因工程药物的分离纯化第18页⑷凝胶过滤

凝胶过滤是以含有大小一定多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中迟缓移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差异可使大分子与小分子分开。基因工程药物的分离纯化第19页

依据蛋白质相对分子量和蛋白质分子动力学体积大小差异，能够利用凝胶过滤来分离纯化目标蛋白。主要应用两个方面：①脱盐和更换缓冲液②蛋白质分子分级分离。在产品形成阶段前用于除去产物多聚体及降解产物。基因工程药物的分离纯化第20页⒊非蛋白质杂质去除DNA、热原质和病毒纯化方法：⑴DNA去除DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质pI在6.0以上,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。亲和层析和疏水层析也有效。⑵热原质去除热原质是肠杆菌科产生细菌内毒素（脂多糖）去除困难。分子量小多肽或蛋白质中热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。⑶病毒去除层析或过滤可将病毒去除。基因工程药物的分离纯化第21页⒊非蛋白质杂质去除DNA、热原质和病毒纯化方法：⑴DNA去除DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质pI在6.0以上,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。亲和层析和疏水层析也有效。基因工程药物的分离纯化第22页⑵热原质去除热原质是肠杆菌科产生细菌内毒素（脂多糖）去除困难。分子量小多肽或蛋白质中热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。⑶病毒去除层析或过滤可将病毒去除。基因工程药物的分离纯化第23页四、选择分离纯化方法

依据

⒈依据产物表示形式来选择分泌型表示产物发酵液体积很大但浓度较低纯化前必须浓缩可用沉淀和超滤法。基因工程药物的分离纯化第24页

产物在周质表示是介于细胞内可溶性表示和分泌表示一个形式,它能够避开可溶性表示蛋白和培养基中蛋白类杂质,在一定程度上有利于分离纯化.为了取得周质蛋白经低浓度溶菌酶处理后,可采取渗透压休克方法来取得。基因工程药物的分离纯化第25页

可溶性表示产物破菌后细胞上清，首选亲和分离方法，或离子交换层析。基因工程药物的分离纯化第26页⒉依据分离单元之间衔接选择

应选择不一样机制分离单元组成一套分离工艺，尽早采取高效分离伎俩。先将最多杂质去除，将费用最高、最费时分离单元放在最终阶段，即通常先利用非特异、低分辨操作单元（如沉淀超滤和吸附等），以尽快缩小样品体积，提升产物浓度，去除最主要杂质（包含非蛋白类杂质）。基因工程药物的分离纯化第27页

随即采取高分辨率操作单元（离子交换层析和亲和层析）凝胶过滤放在最终，这么能够提升分离效果。层析分离次序选择一样主要，合理组合能提升分辨效率，并有利于各步骤间过渡。如离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤。基因工程药物的分离纯化第28页⒊依据分离纯化工艺要求

来选择