动物组织核酸的分离鉴定和含量测定

动物组织核酸的分离鉴定和含量测定动物组织核酸的分离鉴定和含量测定第1页核酸是一类生物高分子化合物，存在于一切生物体内，是组成细胞主要成份。它以与蛋白质结合形式——核蛋白存在于细胞中，是生命基础物质之一，含有储存、复制生物体遗传信息功效，也是蛋白质合成不可缺乏物质，所以它对于生物体生长、遗传、变异等现象起着主要决定作用。核酸分为两大类——核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖或脱氧核糖）和磷酸混合物。核酸个别水解则产生核苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖，一分子核苷酸个别水解后除产生核苷外，还有一分子磷酸。核酸各种水解产物可用层析或电泳等方法分离判定。动物组织核酸的分离鉴定和含量测定第2页DNA和RNA结构动物组织核酸的分离鉴定和含量测定第3页组成核酸戊糖有两种。DNA所含糖为β-D-2-脱氧核糖；RNA所含糖则为β-D-核糖。RiboseDeoxyribose动物组织核酸的分离鉴定和含量测定第4页1.猪肝DNA和RNA分离

核酸分离标准

核酸存在于各种细胞，所以分离方法复杂而多样。又因各种DNA、RNA含量差异，各种分析方法对核酸纯度及量要求有差异，所以在试验前应对所采取方法有所了解和选择。总说来核酸分离与纯化是在溶解细胞基础上，利用苯酚等有机溶剂抽提（核酸溶于缓冲液，即水相），分离，纯化；利用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，收获。动物组织核酸的分离鉴定和含量测定第5页核酸分离普通步骤

1.溶解细胞溶解细胞方法因样品不一样而不一样。有是用十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate,SDS）加NaOH，有是用蛋白酶，有用超声波破碎等方法。2．有机溶剂抽提利用苯酚提取主要使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，到达分离核酸目标。实际上生物样品中含量最多就是蛋白质。3.纯化为了得到纯核酸，可用蛋白酶除去蛋白；用RNA酶除去RNA，得到纯DNA；用DNA酶除去DNA，得到纯RNA。4.沉淀为了除去分离过程中残留有机溶剂，常见方法是加冷乙醇和盐沉淀核酸，再经过离心回收核酸，然后用80%乙醇洗涤沉淀，除去多出盐，以免影响核酸溶解和抑制后续步骤酶促反应。当前开发了许多商品化核酸分离柱，试剂盒,可简单、快速地分离得到纯度很高DNA或RNA，其分离原理有是利用核酸分子量差异，有是利用所需分离核酸特点将其特异性结合到达分离、回收目标。动物组织核酸的分离鉴定和含量测定第6页DNA和RNA分离基础原理依据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度氯化钠溶液中溶解度不一样进行分离，然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来，再利用核酸不溶于乙醇性质将核酸析出，到达分离DNA和RNA目标。在0.14mol/L氯化钠溶液中，RNA核蛋白溶解度大，而DNA核蛋白溶解度小；相反在1mol/L氯化钠溶液中，DNA核蛋白溶解度大，而RNA核蛋白溶解度小，从而使DNA和RNA核蛋白分开。动物组织核酸的分离鉴定和含量测定第7页酚：氯仿：异戊醇抽提酚：有效使蛋白质变性，不能完全抑制RNA酶活性，能溶解带有长poly(A)RNA分子。使用前必须用水饱和并用Tris平衡至pH>7.8，以预防DNA分配到有机相。结晶酚要在182度下重蒸去除醌类等氧化产物，这些物质能够引发磷酸二酯键断裂或促进核酸交联。纯酚比重为1.07，有机相和水相有时极难分开。氯仿：纯酚比重为1.07，有机相和水相有时极难分开。加入氯仿（比重为1.47）能够防止这一问题。同时，酚有时会微溶于水。能够用氯仿将水相中酚去除。异戊醇：降低泡沫产生。动物组织核酸的分离鉴定和含量测定第8页试验步骤动物组织核酸的分离鉴定和含量测定第9页2.核糖和脱氧核糖显色试验加热条件下：D－核糖＋浓盐酸＋苔黑酚绿色D－2－脱氧核糖＋酸＋二苯胺蓝紫色动物组织核酸的分离鉴定和含量测定第10页DNA：1mlSC溶液溶解DNA，然后转移到50ml离心管中，用9ml0.01MNaOH溶液溶解，4000rpm离心10分钟，上清转移到试管中备用。各取上述1mlDNA溶液于两个试管中，其中一个里面加入3ml地衣酚试剂，然后在沸水中20min，观察颜色反应；另外一只试管中加入2ml二苯胺试剂，60℃条件下反应1h，观察颜色反应。动物组织核酸的分离鉴定和含量测定第11页RNA：将RNA沉淀用2ml蒸馏水溶解，然后转移至2只试管中，每只1ml。其中一只试管中加入3ml地衣酚试剂，然后在沸水中20min，观察颜色反应；另外一只试管中加入2ml二苯胺试剂，60℃条件下反应1h，观察颜色反应。动物组织核酸的分离鉴定和含量测定第12页3.核酸定量和纯度测定紫外分光光度法（此法要求核酸纯度很高，1个Abs相当于50ug/ml双螺旋DNA,除了定量测定以外还可进行核酸纯度检测，A260/A280比值，纯DNA为1.8，RNA为2.0，样品中含有蛋白质和苯酚时，A260/A280

比值降低。）定糖法（DNA糖个别为脱氧核糖，RNA糖个别为核糖，分别能够进行二苯胺显色法和地衣酚显色法）定磷法（核酸磷酸个别）动物组织核酸的分离鉴定和含量测定第13页二苯胺显色法原理DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在595nm波优点有最大吸收。DNA在40~400μg范围内，光吸收与DNA浓度成正比。在反应液中加入少许乙醛，能够提升反应灵敏度。动物组织核酸的分离鉴定和含量测定第14页试验方法A260测定:以H2O作为空白，取上清测A260值后确定稀释倍数，使A260值在2.0左右（DNA此时浓度约为100ug/ml。（因为二苯胺法测定范围是40-400ug/mlDNA，所以DNA浓度假如太小会影响测定结果）A280测定：A260/A280比值计算。纯DNA为1.8，RNA为2.0。假如样品中混有RNA，则比值大于1.8；假如样品中混有蛋白质，则比值小于1.8。所用DNA溶液为前面提取后溶解DNA样品。动物组织核酸的分离鉴定和含量测定第15页DNA标准曲线制作和样品测定试剂管号0对照12345样品1样品2DNA标准溶液,ml0.00.40.81.21.62.02.02.0蒸馏水，ml2.01.61.20.80.4000二苯胺试剂,ml4.04.04.04.04.04.04.04.0OD595注：待测溶液中DNA含量应调整至标准曲线可读范围内。样品1和样品2为不一样稀释倍数DNA溶液。按上表加完各试剂后，充分混匀。于60℃水浴中保温1h，冷却后于595nm波优点以0管为空白调零，测定各管光密度（OD595nm）。以DNA含量为横坐标，光密度（吸收值）为纵坐标，绘制标准曲线。动物组织核酸的分离鉴定和含量测定第16页DNA含量计算DNA含量计算：以样品光密度，依据标准曲线计算出相对应DNA含量。并