免疫细胞分离及表面标志检测

免疫细胞分离及表面标志检测免疫细胞分离及表面标志检测第1页2免疫细胞分离及检测※检测：各类免疫细胞及其亚群数量和功效测定※方法：体外法为主※目标：判断机体免疫状态※意义：探讨疾病发病机制、发展、预后、疗效免疫细胞分离是指将各种参加免疫反应细胞从血液或组织中分离出来免疫细胞分离及表面标志检测第2页第一节免疫细胞分离外周血单个核细胞分离淋巴细胞分离T细胞和B细胞分离T细胞亚群分离免疫细胞分离及表面标志检测第3页细胞分离基础原理不一样细胞密度不一样不一样细胞生物学特征不一样不一样细胞表面分化抗原不一样免疫细胞分离及表面标志检测第4页一、外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMC）包含淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。

聚蔗糖-泛影葡胺聚乙烯吡咯烷酮处理硅胶颗粒免疫细胞分离及表面标志检测第5页原理：外周血中各细胞比重不一样，PBMC比重为1.075～1.090，红细胞和多核细胞分别为1.093和1.092，选择比重为1.077±0.001介质，细胞与介质混合后离心，比重比介质大红细胞和多核细胞沉降在下层，而PBMC位于Ficoll分离液上层。

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用1.077±0.001分层液可分离人外周血单个核细胞Ficoll分离液２份6%聚蔗糖蒸馏水溶液１份34%泛影葡胺生理盐水溶液(聚蔗糖-泛影葡胺）Ficoll外周血免疫细胞分离及表面标志检测第7页对分离介质要求：对细胞无毒；等渗；与血浆和分离细胞不相溶；有特定比重。不一样动物PBMC比重有差异：小鼠：1.085大鼠：1.087

人：1.075～1.090免疫细胞分离及表面标志检测第8页方法学评价：分离得到PBMC纯度可达９５％，淋巴细胞占９０％～９５％；操作简便；易于无菌。

免疫细胞分离及表面标志检测第9页二、淋巴细胞分离贴壁粘附法吸附柱过滤法Percoll分离液法（连续密度梯度离心）免疫细胞分离及表面标志检测第10页

利用单核细胞含有贴壁生长特点，将已制备单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶，37℃温箱静置1h，单核细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁细胞几乎全为纯淋巴细胞。橡皮棒刮下贴壁细胞，可得纯单核细胞(无活性）。1.贴壁黏附法PBMC37℃°1hour上清液单核单核淋巴细胞注意：B细胞也可粘附免疫细胞分离及表面标志检测第11页

利用单核细胞含有贴壁生长特点，将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10层析柱中，凡有黏附能力细胞绝大个别被吸附而黏滞在柱层中，从柱上洗脱下来细胞主要是淋巴细胞。2.吸附柱过滤法PBMC洗脱

洗脱液淋巴细胞单核细胞>DC>B细胞>T细胞细胞粘附能力：免疫细胞分离及表面标志检测第12页3.Percoll分离液法Percoll是一个经聚乙烯吡咯烷酮(PVP)处理硅胶颗粒，对细胞无毒性。采取预先形成密度梯度，分离细胞轻轻叠加到液面上Percoll液经离心后可形成一个从管底到液面逐步递减连续密度梯度，不一样密度细胞将悬浮于各自不一样密度区带，从而将密度不等细胞分离纯化。死细胞血小板单核细胞淋巴细胞粒细胞红细胞免疫细胞分离及表面标志检测第13页三、T、B细胞和T细胞亚群

分离磁性微球分离法荧光激活细胞分离仪分离法

免疫细胞分离及表面标志检测第14页1.磁性微球分离法磁性微球：金属小颗粒（Fe2o3,Fe3o4)，其表面包裹有高分子材料（聚苯乙烯，聚氯乙烯等），表面有活性基团（氨基、羧基和羟基），可结合生物大分子物质（抗原，抗体，核酸等）。免疫磁珠：微球表面包被有免疫物质称免疫磁珠。免疫细胞分离及表面标志检测第15页免疫细胞分离及表面标志检测第16页免疫细胞分离及表面标志检测第17页流式细胞分析仪2.荧光激活细胞分离仪分离法免疫细胞分离及表面标志检测第18页E花环沉降法尼龙毛柱分离法T细胞和B细胞分离免疫细胞分离及表面标志检测第19页1.E花环沉降法（E受体/CD2与绵羊红细胞结合）B细胞T细胞Ficoll液离心溶解红细胞T细胞B细胞免疫细胞分离及表面标志检测第20页2.尼龙毛柱分离法此法简便快速，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响，T细胞纯度可达90%以上。免疫细胞分离及表面标志检测第21页免疫细胞分离及表面标志检测第22页四、不一样细胞分离方法综合评价早期细胞物理属性细胞生物属性分辨率和灵敏度不高现在（依据细胞表面标志）免疫磁珠流式细胞仪分辨率和灵敏度高缺点：不适合用于细胞表面分子不清细胞分离，试剂和仪器昂贵免疫细胞分离及表面标志检测第23页五、分离细胞保留和活力检测1.分离细胞保留

对保留液要求：等渗，具pH缓冲作用，并对细胞无毒性（Hanks、Tc-199、RPMI1640）。如需短期保留，置4℃放置很好，可减低细胞代谢活动。如需长久保留，应放入液氮罐中在深低温(-196℃)条件下保留细胞。免疫细胞分离及表面标志检测第24页2.细胞活力测定细胞活力常见活细胞占总细胞百分比表示，细胞活力测定常见简便方法是台盼蓝(trypanblue)染色法。死细胞着色，染成蓝色；活细胞拒染。

用血细胞计数器在显微镜下观察到着色和不着色细胞，计数200个细胞，以不着色细胞百分率即代表细胞活力。免疫细胞分离及表面标志检测第25页一、T细胞表面标志检测二、B细胞表面标志检测四、细胞表面标志检测意义

三、自然杀伤细胞表面标志检测

第二节淋巴细胞标志及亚群分类免疫细胞分离及表面标志检测第26页一、T细胞表面标志及其亚群CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（helpTcell,Th）CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞（cytotoxicTcell,TcorCTL）CD4+CD25+调整性T细胞（regulatoryTcell,TrorTreg）免疫细胞分离及表面标志检测第27页二、B细胞表面标志

SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，个别CD分子是B细胞主要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是判定B细胞可靠指标。CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指B细胞。免疫细胞分离及表面标志检测第28页CD19+CD5-:B2细胞SmIg：膜表面免疫球蛋白CD19（B细胞标志）CD21CD32(FcRⅡ)CD35（C3b/C4b受体）CD40（成熟B细胞）CD80/86（活化B细胞）CD19+CD5+:B1细胞CD22和CD23二、B细胞表面标志

免疫细胞分离及表面标志检测第29页三、NK细胞表面标志

人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细胞。免疫细胞分离及表面标志检测第30页淋巴细胞表面标志检测临床意