鸡马立克氏病疫苗研制进展

鸡马立克氏病疫苗研制进展

马齐克病（md）是由马齐克病毒科和细胞结合性马齐克病毒科（mdv）引起的高度接触性感染和淋巴组织增生性肿瘤。以患鸡内脏、外周神经、性腺、皮肤及眼出现淋巴样细胞浸润和形成肿瘤为特征。该病是第一个能用疫苗预防的肿瘤性疾病,因此受到了医学界、兽医学界、病毒学界的广泛关注。到目前为止,还没有有效的方法来治疗MD患鸡,仍通过疫苗预防控制该病的发生。近50年来,随着养鸡业的迅速发展,MDV的毒力不断增强,对常规疫苗的抵抗力增加,甚至宿主范围都有所扩大。大约每十几年发生一次毒力跃迁,与常规疫苗的发展几乎同步。疫苗的研发和使用在病毒毒力进化过程中是否起到推波助澜的作用,如何采取措施缓解病毒毒力的增强?本文对毒力进化以及疫苗研发进展进行了分析和概述,提出了减缓毒力增强的途径。1马丽克病病毒的进化1.1低日龄鸡群中淋巴肿瘤的发病情况Marek在1907首次报道MD,当时主要发生在成年鸡只,发病率和死亡率都很低。随后报道中显示该病表现出神经性症状,具有传染性。1922年,该病在美国大面积蔓延,从过去很低的死亡率上升到20%,剖检中发现内脏组织中具有淋巴肿瘤。1950年末,呈现出大面积暴发,在低日龄鸡群中最先发病,死亡率达到30%或更高,伴有神经损伤。1965年分离出区别于“基础MD株(mMDV)”的“强MD株(vMDV)”,该毒株成为20世纪60年代最严重的毒株形式。1970年随着疫苗使用,该病首次得以控制在美国,再一次毒力增强是在20世纪70年代末,暴发了一场无法解释的免疫后鸡群发病事件我国也于1973年首次证实了MD的存在,每年因此病造成的损失达数千万元甚至上亿元。近年国内学者也相继发现了不同的毒株。韦平1.2双价疫苗vvddv毒株在养禽业发生变革的20世纪50年代,在温和型(mMDV)毒株的基础上出现了MDV强毒(vMDV)毒株;自70年代初期引入MD单价疫苗(HVT)后大约10年,出现MDV超强毒(vvMDV)毒株;自引入双价疫苗后10年,又出现MDV超超强毒(vv+MDV)毒株。其变化情况见图1。对于病毒进化的原因存在着诸多观点,被公认的原因主要有以下几个方面:1.2.1mdv在易感宿主上的作用第二次世界大战对蛋白质需求的提高,加速了养禽业的发展。养禽业由散养型变成了密集型饲养,表现为高饲养密度及高生长速度和产量的特征。在这种情况下,MDV在易感宿主上持续作用,增强了毒力。另外,为了提高产量,加强了遗传选育工作,但由于抵抗MD会降低产量,因此没有作为一个特征性进行选择,使MDV毒力得到了进化。同时密集的养禽业农场之间的引种,也促进了病毒的蔓延。1.2.2mdv早期感染自20世纪70年代开始应用疫苗以来,MDV分离株毒力的增强与效力成规律增加的疫苗应用有着密切的关系。主要引起的原因是:①过度免疫:现在任何一个MD都不能通过消毒来消除,可能是该病毒进化的主要契机。Gandon②疫苗使用剂量及使用方法:细胞结合型MDV非常不稳定,有试验证明如果疫苗保护剂量不足会导致该病反复出现。在一个针对43个国家的调查结果中显示,37%的兽医在使用疫苗时使其温度升高,50%兽医将MD和其它疫苗混合注射1.2.3功能缺乏的宿主有专家认为毒力增强可能与免疫鸡群中MDV毒力基因的增强复制过程发生突变有关。但有研究显示,MDV毒力变异不可能源自抗原漂移,而主要来自病毒与宿主的相互选择中发生的突变,因而其致病株的血清型未发生变化。美国华盛顿大学的Kerr博士通过建立一种宿主(E.coli)与病原(T4噬菌体)互相作用的模型来研究病毒的生态学及其动力学。发现宿主菌的移动及相互间的接触可对此产生深远的影响。当毒力与其它特性如宿主间传播或宿主内竞争能力的变化相一致时,低水平的毒力可得到提高。病毒毒力进化是多方面作用的结果,很多实验室都在做这方面的研究,但是一个限制因素是进化的病毒非常容易受多个因素影响,随着研究技术的提高,其进化原因也将会得到更全面的揭示。2马立克病毒苗的研究2.1用天然毒素生产疫苗2.1.1hvt疫苗血清Ⅲ型疫苗主要是指火鸡疱疹病毒(HVT)疫苗,其代表毒株Fc-126,是由美国学者Writter博士从火鸡群中分离出来的1株无致瘤型毒株2.1.2血清型mdv血清Ⅱ型病原毒株是从临床正常的鸡群中分离到的非致病性毒株,属自然筛选的弱毒疫苗。血清Ⅱ型MDV都是天然非致病性的,广泛分布于鸡群中,这种疫苗毒可通过接触传播,感染后第5周产生很强的免疫力。这一血清型具有代表性的是SB-1株,是第一个被通过可以用于制备疫苗的毒株2.1.3培养鸡群的致瘤性和接触性第一个血清Ⅰ型疫苗是1969年英国学者Churchill等CVI988最早是荷兰人Rispens从一群无临床症状的鸡群中分离而得的血清Ⅰ型中等毒力毒株,由于其天然致病、致瘤趋向,经Witter在火鸡胚成纤维细胞上传26~35代致弱后,除在易感鸡群连续继代培养仍有轻微致瘤性外,对其它鸡群则基本丧失致瘤性和接触性传染力。后利用其制备的疫苗可以有效控制预防vvMDV和vv+MDV。CVI988疫苗目前已成为控制MD主要疫苗之一。利用插入突变的方法来致弱血清Ⅰ型毒株是一个很好的方法。第一个利用插入致弱的毒株JM/102W表现出网状内皮增生病病毒的特性,通过插入一个逆转录长末端重复(LTR)到MDV基因组中端重复区,最终结合成RMl病毒株MD活疫苗(814株)其疫苗种毒是从多年未发生过MD的鸡场分离,属于血清Ⅰ型,自然弱毒株。实验室试验证明该疫苗预防效力比HVT疫苗高28.5%,实际预防效力能使鸡的死亡率由HVT预防的7%下降到2%,而且814株疫苗株的预防效力受母源抗体的影响不明显,对有同种母源抗体而无HVT抗体鸡的预防效力平均为89%,而HVT的预防效力只有60.5%,该疫苗免疫后8天产生坚强的免疫保护力2.1.4血清型菌株对鸡的保护力1980年美国首先发生HVT疫苗免疫失败的情况,接着其他国家出现类似事件。病毒分离也表明MDV毒力在HVT疫苗使用10年中发生变异和递进。新的危机促使各国研究者做出新的尝试。Schat等发现3种血清型的三联疫苗对鸡的保护力则更高,达到90%。于是,在HVT疫苗基础上出现了综合各种血清型保护作用的二联疫苗如SB1+HVT、301B/1+HVT、CVI988+HVT、Z4+HVT以及三联疫苗如CVI988+SB1+HVT和814+SB1+HVT等。也有一些争论认为血清Ⅰ型分别与血清Ⅱ型和血清Ⅲ型制作的联苗不具备协同作用,但是另有报道显示HVT与戊二醛灭活血清Ⅰ型联合的二价苗从羽囊观测可有效地提高保护率2.2对植株的作用传统MD疫苗的使用客观上大大降低了MD的发生和危害,但并不能对不断发展的强毒株和超强毒株起到有效遏制作用。另外多联苗使用可导致B淋巴细胞机能障碍,使鸡免疫力下降,再则是除HVT苗以外的其它MD苗均有严格的活细胞结合性,使疫苗的液氮保存运输非常不便等等。因此,随着分子生物学技术的发展和进步,利用基因重组工程研制MD疫苗成为一个热点,并取得一些重要进展2.2.1血清型gb的应用由于MDVgB基因表达的糖蛋白gB是最重要的保护性抗原,所以基因重组疫苗的研究重点大都集中在利用其它载体表达gB糖蛋白。目前,MDV3种血清型gB的重组禽痘病毒(FPV)都已构建成功在杆状病毒表达系统中,gB及gC基因也已成功地在昆虫细胞中得到表达。将表达的gB和gC分别免疫或混合免疫鸡后发现,gB可轻度降低死亡率及减少MDV发病率,而gC则无保护性。由于gB保护力有限且需多次免疫,同时还要使用佐剂,所以此亚单位疫苗作为真正的疫苗广泛应用并未现实。以HVT为载体的MDV重组疫苗也进行了研究。此载体可插入多个外源基因,具有多重保护的潜力。Ross等2.2.2基因缺失苗的研发人为地剔除MDV的致病性(致瘤性)基因从而构建基因工程缺失疫苗,在CEF上传代后可使之失去致瘤性是基因缺失苗的主要研发思路。Cantello等虽然某些基因缺失可使病毒的毒力降低,但并不能使MDV致瘤性完全丧失,而且基因缺失的同时使病毒在细胞内复制的能力下降,甚至达不到目前常规疫苗的保护水平,所以这种疫苗作为商业化应用,还要做进一步研究。2.2.3mdv基因检测核酸疫苗也是将来MDV疫苗研制的一个重要方向。研究的原理是将编码免疫原的基因插入真核表达质粒中,质粒在细菌中复制,提取并纯化质粒后,再采用一定方法给动物接种。当质粒在宿主细胞中表达,表达产物可激发机体产生免疫应答。李建伟等将含MDVgB基因的UC19质粒直接注射1日龄的鸡体中,80%的鸡能抵抗强毒的攻击。Tischer等核酸疫苗存在整合到宿主基因组引起宿主原癌基因活化和肿瘤抑制基因失活的危险,也存在刺激产生抗DNA抗体和持续表达外源基因可产生的不良后果,同时肌肉注射产生免疫力需要大量抗原或使用基因枪,成本很高,因此对家禽疾病控制来说,核酸疫苗的应用还需要进一步研究。3控制mdv中毒的发展疫苗使用在MD防控方面发挥了显著的作用,但是不能忽视其在推进毒力进化过程中所扮演的角色,因此积极地采取应对措施3.1利用乙酰化材料进行免疫药物的使用和认证对于胚胎或1日龄的雏鸡只要接种MDV几小时后就会感染,如果在疫苗使用中配备一些免疫增强剂,如细胞因子或者佐剂,就可以增强体内免疫应答,促进早期母体免疫系统的作用。乙酰化甘露聚糖是从芦荟中提取的一种多糖,自1992年已经通过认证可以作为马立克氏病疫苗的佐剂使用,但是目前使用的还比较少。一些研究者也作了一些试验证明细胞因子可以增加细胞免疫应答,比如Djeraba等3.2次免疫试验二次免疫在商业鸡群中已经使用了很多年,在欧盟和一些发展国家都成为一个常规方法,但是在美国并没有被采用。这可能是之前有一些试验表明二次免疫并不能带来更好的保护效果。Ball在鸡21日龄时采用二次免疫并没有达到预期的效果。但是最近Witter等设计了二次免疫试验,并且观测到一些结果。实验数据显示,在第一次使用低效力疫苗,二次免疫之后,可能产生双倍的免疫效力,但是这些需要进一步证实。如果这种作用确实,二次免疫将是一个提高疫苗作用的有效途径。3.3免疫效力的选择MDV毒力增强与疫苗免疫不当有一定的关系,制定有效的免疫程序从而控制病毒毒力增强是非常有用的。在连续的不同批鸡分别选用不同的疫苗,可能分散病毒变化的压力,降低由于免疫选择给病毒带来的变异压力,并且提高免疫效力。为了实现这一策略,就需要有2个或2个以上同等效力的疫苗株供选用。但到目前为止,还只有CVI988效力最好,如何选择还需要更多的试验证明。另外交互疫苗的使用方法不适用于蛋鸡和种鸡。3.4加强对鸡的控制和预防早期感染在降低MD疫苗效力方面起重要作用。降低商品鸡早期感染的最好做法就是给刚孵化的雏鸡提供无残留灰尘和羽毛碎屑的环境。对鸡群需要实行“全进全出”措施来降低从其它鸡传播病毒的可能性。在美国,种鸡群基本上能满足以上要求,在蛋鸡场也已执行了严格的生物安全措施和彻底的清扫,但又趋向于不同年龄混养,这为MD传播埋下了隐患。在商品代肉雏鸡场,必须采取彻底措施来消除前一批鸡留下的传染性物质,如果为了降低成本,放松管理,有可能得不偿失,引起更严重疾病流行。因此,加强管理,最大限度地延缓早期感染,可有效提高各种疫苗的效力。通过控制病毒感染扩散,缓解MDV毒力增强。3.5md抗性和易感鸡群的分子机制在使用疫苗以前,遗传抵抗是控制MD的唯一方法。由于疫苗的引入,有关遗传抵抗的研究逐渐减少。但是随着基因组序列的完成,将打开控制禽病的另一大门。MDV与许多人的肿瘤病毒一样,尽管可感染所有的个体,但仅导致其中遗传易感的个体发生肿瘤。1933年起,与MD发生相关的宿主基因型及其应用得到关注和研究,1968年Cole首先将这种遗传抗性大概分为MHC和非MHC两大类。随着生物技术的不断提高,通过DNA测序鉴定特异的SNPs、mRNA和miRNA的转录组学以及蛋白组学的技术,鉴别遗传控制MD抗性差异,为阐明MD易感与抗性的分子机制提供素材。美国、日本、加拿大等学者对不同的MD抗性和易感机体内的特定抗原编码基因进行比较,对淋巴样肿瘤细胞中肿瘤抑制蛋白家族的某个成员进行检测,得出了诸多有价值的研究成果。遗传抵抗力只能缓慢提高,而且能够达到的程度也是有限的。但遗传抵抗力对辅助疫苗免疫是非常有价值的,选择遗传抵抗力的鸡群就能够更好地预防来自毒力逐渐增强的野毒株的攻击。随着更多研究的深入,遗传抵抗将会使这种选择过程变得更加方便、成本更加低廉。4疫苗的使用有利于防止接种病毒的感染,从而提高其