克氏原螯虾寄生虫病的病原分离鉴定及耐药分析

克氏原螯虾寄生虫病的病原分离鉴定及耐药分析

克氏原始繁殖虾（procalcalni）通常被称为小龙虾，主要分布在江苏省、浙江省、湖北省、湖南省、安徽省、上海市和山东省的10多个省（市）和地区。随着我国克氏原螯虾人工养殖热潮兴起,相关疾病的报道也陆续出现,这些疾病主要由嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)2012年5月下旬,安徽省滁州市全椒县2个稻田养殖场的克氏原螯虾出现爆发性疾病,症状为病虾不摄食,螯足无力,行动迟缓,应激能力较弱;部分个体体表皮肤变黑,甲壳内壁无白斑及其他明显症状,解剖可见肝胰脏颜色淡黄,肠道内没有食物。本课题组从2个养殖场的濒死虾肝胰腺分离到细菌,感染克氏原螯虾确定其致病性,结合理化特性和16SrRNA、gyrB基因序列,16SrRNA基因系统进化分析,鉴定病原,并测定了该菌对20种抗生素的敏感性,期望为克氏原螯虾细菌性疾病的防治提供理论依据。1材料和方法1.1病原菌分离方法患病克氏原螯虾取自安徽省滁州市全椒县2个养殖场,每个养殖场取20尾鲜活病虾,平均体重20g,用保温箱冷藏带回实验室,选存活的8尾进行病原分离。供试健康克氏原螯虾购自某公司位于池州市东至县大渡口镇新河口广丰圩长江段的养殖场,虾体长11.3~12.5cm,体重20.8~30.7g。1.2细菌试剂和引物胰胨大豆琼脂(TSA)、胰酶大豆肉汤(TSB)、脑心浸液肉汤(BHI)、MH琼脂(MHA)、琼脂、LB肉汤(LB)为青岛海博生物技术有限公司产品。革兰氏染色液、芽孢染色液、微量生化管、20种抗生素纸片和柠檬酸杆菌CMCC48017购于杭州天和微生物试剂有限公司。荚膜染色液为自配。Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(批号:SK8255)购于上海生工生物工程股份有限公司,PCR引物也由该公司合成。PCR相关试剂、TakaraMINIBESTagarosegelDNAextractionkit(D823A)、pMD18-T购于Takara公司。1.3菌株组合分离取鲜活的患病克氏原螯虾8只,无菌取肝胰腺,剪碎,粘取一些组织液接种于TSA、含5%绵羊血TSA和BHI琼脂平板培养基上,28℃培养24h后,随机挑取8个菌落重复划线分离,直至得到纯培养。将纯化的菌株分别用TSB培养基28℃过夜摇匀培养,加终浓度20%甘油,-20℃冰箱保存用于进一步鉴定。1.4人工感染试验1.4.1克氏原螯虾幼虾注射前后养殖将鲜活患病的克氏原螯虾的鳃组织无菌剪碎,匀浆,加10倍生理盐水,10000r/min离心,0.22μm滤膜过滤,肌肉注射健康克氏原螯虾20尾,注射后养殖观察30d。1.4.2微生物指标检测将代表株X120523在28℃培养18~24h后,用0.65%无菌生理盐水洗下,制成菌悬液,结合显微计数和光电比浊计数法(波长625nm)测定菌液中细菌浓度,并将菌液最终浓度调至5×101.5微量生化管里进行致病菌的形态及生理生化特性试验按照文献[7]和文献[8]所述方法,在微量生化管里进行。并用柠檬酸杆菌(CMCC48017)作参考菌株,进行同步试验。1.6基因组dna提取取分离株接种于TSB中28℃过夜培养,用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA作为PCR模板。16SrRNA基因PCR扩增的通用引物分别为fD1/rD11.7序列同源性分析将代表株X120523的16SrRNA和gyrB基因序列通过NCBI的Blast检索系统(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行序列同源性分析,使用ClustalX2软件与从GenBank数据库中获得的柠檬酸杆菌属(Citrobacter)的11个种模式株1.8药物过敏试验试验采用纸片扩散法2结果2.1菌株筛选及pcr扩增8尾克氏原螯虾肝胰腺组织液在TSA和BHI琼脂上均长出大量色泽和形态均一的菌落,菌落表面整齐,颜色透明,中间隆起,乳白色,大小为1~2mm。在5%绵羊血TSA平板上形成典型的γ溶血。从8尾病虾分离的细菌中各随机挑选1个菌株进行PCR16SrRNA扩增、测序,获得的8条序列基本一致,挑选一株为代表并编码为X120523进一步鉴定。组织匀浆过滤液注射感染克氏原螯虾,没有虾发生死亡或病变。将代表株X120523系列稀释,肌肉注射健康克氏原螯虾,病原对克氏原螯虾的半致死浓度约为3.16×102.2理化特性鉴定结果代表株X120523的革兰氏染色、芽孢染色和荚膜染色结果显示细菌为革兰氏阴性菌,两端钝圆,短杆状,无芽孢,无荚膜。分离株的38个理化特性鉴定结果见表2。其中除棉籽糖、七叶苷的鉴定结果与参考株柠檬酸杆菌CMCC48017的鉴定结果不同外,其他结果均与参考株的相应结果一致,表明X120523属于柠檬酸杆菌属。该菌的各项理化指标结果符合弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)相应指标的特征2.3srrna基因序列及系统发育树分析代表株X12052316SrRNA和gyrB基因序列长度分别为1464bp和1171bp,在GenBank中登录号分别为KF156749和KF156750。将X120523的16SrRNA基因序列进行同源性检索,显示的100条序列同源性均为99%以上,基本为柠檬酸杆菌属细菌。X120523与柠檬酸杆菌属细菌16SrRNA基因系统发育学分析显示,X120523与弗氏柠檬酸杆菌(登录号为JN585667)聚为一分支,置信度为87%,它们与4种细菌模式株(弗氏柠檬酸杆菌AJ233408、魏氏柠檬酸杆菌AF025373、莫林柠檬酸杆菌NR_028688和布氏柠檬酸杆菌AF025368)的同源性均很高,系统发育树如图1所示。X120523gyrB基因同源性搜索结果显示与弗氏柠檬酸杆菌的同源性最高,达95%以上。2.4种氨基糖苷类抗生素和头孢他啶代表株X120523对7种喹诺酮类抗生素、5种氨基糖苷类抗生素和头孢他啶敏感,对四环素和复方新诺明中度敏感,对5种抗生素(克林霉素、头孢氨苄、麦迪霉素、新生霉素和强力霉素)耐药。3克氏原螯虾的rb基因分析代表菌X120523的回归感染试验表明其能导致克氏原螯虾死亡。结合理化特征、16SrRNA基因和gyrB基因分析,代表菌X1