细胞基因组DNA的提取

试验一细胞基因组DNA提取一、试验原理1、核酸分类DNA主要存在于细胞核染色体中。核外也有少许DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。RNA存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。细胞基因组DNA的提取第1页分离纯化核酸总标准：

①应确保核酸一级结构完整性；②排除其它分子污染。核酸纯化应到达要求：

①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用有机溶剂和过高浓度金属离子；②其它生物大分子污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子污染。2、核酸制备普通标准一、试验原理细胞基因组DNA的提取第2页核酸制备时应注意事项:①尽可能简化操作步骤，缩短提取过程。②降低化学原因对核酸降解。③降低物理原因对核酸降解：机械剪切力和高温④预防核酸生物降解。

3、核酸制备普通标准一、试验原理细胞基因组DNA的提取第3页核酸制备步骤：破碎细胞提取纯化I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质

V.核酸溶解在适量缓冲液或水中细胞基因组DNA的提取第4页核酸酶抑制和抑制剂降低温度，改变pH及盐浓度，都利于对核酸酶活性抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更加好。对于DNA，抑制DNase活力很轻易，但预防机械张力拉断则更主要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更主要。4、核酸制备普通方法和原理一、试验原理细胞基因组DNA的提取第5页核酸酶抑制和抑制剂DNase抑制

①加入少许金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本能够全部失活。②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。细胞基因组DNA的提取第6页核酸酶抑制和抑制剂RNase抑制①操作要带手套。②全部器皿要严格消毒，③试剂处理④低温操作⑤在分离过程中要加入一定RNase抑制剂。

细胞基因组DNA的提取第7页核酸制备中惯用去垢剂核酸本身带负电荷，结合带正电荷蛋白质。用于核酸提取去垢剂，普通都是阴离子去垢剂，去垢剂作用：1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2．溶解核糖体上面蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；3．对RNase、DNase有一定抑制作用。如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠细胞基因组DNA的提取第8页核酸制备中惯用蛋白质变性剂

蛋白质变性剂作用：1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。3.一些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞作用。

如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC细胞基因组DNA的提取第9页核酸制备中惯用酶

DNaseRNase蛋白酶K溶菌酶

细胞基因组DNA的提取第10页核酸提取普通过程1）破碎细胞（预防核酸酶作用）

微生物：溶菌酶、SDS裂解。

高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰冻法：重复冻融或液氮冻后组织捣碎。

动物：液氮处理后用匀浆器破碎。

细胞器DNA：首先纯化细胞器。

以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂细胞基因组DNA的提取第11页核酸提取普通过程2）破碎抽提核酸除去杂质1．首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒核蛋白与其它成份分离2．使核酸与蛋白质分离3．除去脂类4．多糖除去细胞基因组DNA的提取第12页核酸提取普通过程3）核酸纯化依据所需核酸性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最终得到均一核酸样品。

细胞基因组DNA的提取第13页4）核酸样品保留核酸保留主要条件是温度和介质

温度：4℃（5℃）最正确和最简单-70℃是长久保留良好温度，为一次性保留-20℃保留

保留介质：TE缓冲溶液(最惯用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0细胞基因组DNA的提取第14页试验目标细胞基因组DNA的提取第15页材料与试剂细胞基因组DNA的提取第16页试验操作与注意事项,1000rpm,5min离心细胞基因组DNA的提取第17页细胞基因组DNA的提取第18页细胞基因组DNA的提取第19页四、注意事项——材料准备最好使用新鲜材料，低温保留样品材料不要重复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，不然会造成DNA降解含病毒液体材料DNA含量较少，提取前先富集细胞基因组DNA的提取第20页四、注意事项——细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，造成DNA量少，纯度低针对不一样材料，选择适当裂解预处理方式：植物材料－－液氮研磨动物组织－－匀浆或液氮研磨组培细胞－－蛋白酶K细菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡细胞基因组DNA的提取第21页四、注意事项——核酸分离、纯化采取吸附材料吸附方式分离DNA时，应提供对应缓冲体系采取有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应确保一定转速和时间针对不一样材料特点，在提取过程中辅以对应去杂质方法细胞基因组DNA的提取第22页四、注意事项——核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70％乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长久储存提议使用TE缓冲液溶解TE中EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可预防DNA发生酸解

细胞基因组DNA的提取第23页DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70％乙醇洗涤次数（2-3次）五、DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。

原因对策细胞基因组DNA的提取第24页材料不新鲜或重复冻融未很好抑制内源核酸酶活性提取过程操作过于猛烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染重复冻融尽可能取新鲜材料，低温保留材料防止重复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富材料DNA时，可增加裂解液中螯合剂含量细胞裂解后后续操作应尽可能轻柔全部试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保留于缓冲液中，防止重复冻融问题二：DNA降解对策

原因五、DNA提取常见问题细胞基因组DNA的提取第25页试验材料不佳或量少破壁或裂解