检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器

检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第1页2第一节化学发光免疫分析技术第二节电化学发光免疫分析第三节时间分辨荧光免疫分析法第四节荧光偏振免疫分析法第五节化学发光免疫分析临床应用内容概述:检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第2页3教学目标和要求

掌握化学发光免疫分析技术基础原理、反应底物和标识方法以及反应类型。

熟悉电化学发光免疫分析基础原理和标识物，时间分辨荧光免疫分析法基础原理及其标识物和螯合物。

了解荧光偏振免疫分析法基础原理和技术特点，化学发光免疫分析临床应用

检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第3页4第一节化学发光免疫分析技术基础原理反应底物标识方法反应类型相关仪器检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第4页5一、基础原理化学发光，是指伴随化学反应过程所产生发光发射现象。一些物质在进行化学反应时，吸收了反应过程中所产生化学能，使反应物分子形成电子激发态，当电子从激发态返回到稳定基态时，多出能量就以光子形式发射出来。这一现象称为化学发光。A+BC*+D,C*C+h

检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第5页6(一)产生化学发光反应条件和过程化学发光与荧光区分:化学能光能化学发光反应条件:反应必须提供足够激发能焓变(△H)介于170～300kj·mol-1之间，才能在可见光范围观察到化学发光现象吸收了化学能后处于激发态分子或原子，必须以光子形式将能量释放出来，或者将能量转移到另一个物质分子上并使该分子激发，当被激发分子回到基态时，也以光子形式释放能量检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第6页7(二)化学发光效率化学发光反应发光效率(φCl)又称为化学发光总能量产生率φCl取决于生成激发态产物分子化学激发效率(φCE)和激发态产物分子发射效率(φEM)。普通化学发光反应，φCl值约为10-6

检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第7页8(三)强度与反应物质浓度之间关系反应物浓度反应速度化学发光反应所发出光强度检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第8页9(四)化学发光反应类型直接化学发光间接化学发光1．直接化学发光化学反应释放化学能激发是反应产物分子A+BC*+D,C*C+h

检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第9页102．间接化学发光(敏化化学发光)在化学反应中，激发能传递到另一个未参加化学反应分子上，使该分子到达电子激发态，再由激发态分子返回到基态时发光；或反应首先生成一个高能量中间体，此中间体再将能量转移给另一个未参加化学反应分子，使该分子到达电子激发态，再由激发态分子跃迁回到基态时发光过程。A+BC*+D,C*+FF*+E,F*F+h

检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第10页11二、反应底物(发光剂或发光底物)在化学发光反应中，参加能量转移并最终以发射光子形式释放能量化合物发光免疫技术中常见化学发光底物:１．氨基苯二酰肼类主要有鲁米诺(3-氨基苯二甲酰肼，luminol)和异鲁米诺(5-氨基苯二甲酰肼，isolumino1)及其衍生物。2．眯唑类化合物较常见是2，4，6-三苯基咪唑，即洛粉碱(lophine)。3．吖啶酯类经典代表是N，N-二甲基二吖啶硝酸酯，即光泽精(1ucigenin)。4．苯酚类化合物其中主要有邻苯三酚，即焦性没食子酸。5．芳香草酸酯类主要有双-(2，4，6，-三氯苯基)-草酸酯(TCPO)和双-(2，4-二硝基苯基)-草酸酯(DNPO)。6．(金刚烷)-1，2-二氧乙烷及其衍生物

检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第11页12检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第12页13三、标识方法化学标识生物标识化学标识:用于化学发光(酶)免疫测定直接用发光物质(如鲁米诺、吖啶酯类等)标识抗体或抗原以催化剂(如HRP、GOD等)和／或协同因子(如ATP、NAD等)标识抗体或抗原按照标识物应用:检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第13页14按照被标识物结构或性质:对小分子物质(如甾体激素、药品等)标识对大分子抗原、抗体标识(如蛋白质、核酸等)以及对一些配基和载体标识检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第14页15按照标识反应过程和形成结合物结构特点:直接偶联间接偶联经过偶联反应，使标识物分子中反应基团直接连接在被标识分子反应基团上。在标识物与被标识物之间插入一条链或一个基团，使两种物质经过这种引入“桥”连结成结合物碳二亚胺缩正当、过碘酸盐氧化法、重氮盐偶联法和混合酸酐法琥珀酰亚胺活化法、O-(羧甲基)羟胺法、异硫氰酸酯衍生物和戊二醛法检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第15页16检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第16页17常见标识方法1．碳二亚胺（EDC）缩正当此法可用于蛋白质分子中游离羧基或游离氨基标识。常见缩合剂有l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和二环己基碳二亚胺(DCC)直接偶联检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第17页18

2．重氮盐偶联法(又称重氮化法)此法简易、成本低、重复性好，但不适合用于脂肪伯胺基发光剂，因其生成重氮盐不稳定，即使在０℃也会生成氮气。另外，ABEI等伯胺基位于侧链者也不适用此法。芳香伯胺直接偶联检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第18页193．过碘酸盐氧化法标识物可用发光剂或催化剂，适合用于芳香伯胺或脂肪伯胺发光剂，标识方法稳定标识物不易脱落，但此法不适合用于无糖基蛋白质和含有糖基但氧化后会影响免疫学活性蛋白质。直接偶联检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第19页204．戊二醛法

间接偶联芳香伯胺基氨基因为戊二醛在溶液中以单体和聚合体形式存在，后者占多数，所以在标识反应中双方分子间组成较大距离，降低了在抗原抗体反应时空间位阻；但因偶联不易定量控制且缺乏特异性等而未得到广泛应用双功效偶联剂检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第20页215．琥珀酸酐法(环内酸酐法)间接偶联此法没有双功效交联剂不良反应，能实现标识物和蛋白质分子间单向定量缩合，标识效率高，已经有商品化试剂供给。检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第21页226．异硫氰酸酯衍生物法此法标识温和、稳定，取得标识物不易脱落，且不损失蛋白质等生物活性发光标识物标识物间接偶联检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第22页237．O-(羧甲基)羟胺法O­-羧甲基衍生物8．混合酸酐法检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第23页24四、反应类型化学发光免疫分析化学发光酶免疫分析微粒子化学发光免疫分析依据发光免疫分析中发光反应不一样体系和标识方法不一样检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第24页251.化学发光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay，CLIA)用化学发光剂直接标识抗原或抗体,免疫反应后生成标识免疫复合物,经过开启发光试剂(NaOH-H2O2)作用于AE而发光，发光强度依赖于免疫反应物中化学发光剂浓度。原理:常见化学发光剂:吖啶酯(acridiniumester，AE)类化合物反应特点:CLIA检测小分子抗原采取竞争法；大分子抗标准采取夹心法。与大分子结合不会减小所产生光量，从而增加灵敏度。强烈直接发光在1s内完成，为快速闪烁发光。应用:检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第25页261)直接化学发光使用吖啶酯(AE)作为标识物，无需附加催化剂。AE氧化直接发光，氧化反应在430nm处快速发光并在1s内到达峰值。发光强度是I125在1min内发光强度十万倍，所以系统该含有高速度、产光强等特点。

2)AE有甲基，增加了试剂稳定性，使试剂稳定性好，使用期更长。

3)AE作为化学发光标识物，对温度及pH等外界环境改变不敏感，故其含有很高精密度。

4)AE相对分子质量水常小(MW：481)，使其对结合反应空间位阻作用降低，增加扩散率，提升了灵敏度，可达l0-15mol·L-1。

5)AE是以共价键结合抗体而不影响抗体结合抗原反应，故不影响发光。

6)AE加碱后，发光是在一暗盒中进行，其光量值与浓度有着良好线性关系，且本底较低。吖啶酯特点检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第26页272．化学发光酶免疫分析(chemiluminescentenzymeimmnunoassay，CLEIA)采取参加发光效应酶作为标识物标识抗体或抗原，免疫反应后形成酶标识抗原抗体复合物，利用鲁米诺作为发光底物在酶和开启发光试剂(NaOH-H2O2)催化下，产生发光反应，发光强度依赖于酶免疫反应物中酶浓度。原理:

底物产物发光Ag+Ab*Ag-Ab**检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第27页28常见标识物:辣根过氧化物酶(HRP)或ALP反应特点:①标识物常标识抗体；②标识物作为发光反应催化剂，本身不发光。检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第28页293．微粒子化学发光免疫分析(microparticlechemiluminescenceimmunoassay，MLIA)以顺磁性微粒作为载体包被抗体，利用磁性微粒能被磁场吸引，在磁力作用下发生力学移动特征，快速捕捉到被测抗原。加入碱性磷酸酶标识第二抗体，形成磁性微粒包被抗体-抗原-酶标识抗体复合物经洗涤去掉未结合抗体后，加入ALP发光底物AMPDD，AMPDD被复合物上ALP催化发光,发射光所释放光子能量被光量子阅读系统统计，经过计算机处理系统将光能量强度在标准曲线上转换为待测抗原浓度。原理:检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第29页30

AMPDD一侧芳香基团上磷酸酯被水解，失去一个磷酸基而生成一个中等稳定中间体AMPPD(半衰期2～30min)，此中间体经过内部电子转移而裂解为一分子金刚烷酮和一分子激发态间氧苯甲酸甲酯阴离子，当回到基态时发出波长为470nm光)检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第30页31常见标识物:ALP反应特点:①可采取竞争法和夹心法,多采取双抗体夹心法②采取磁性微粒作为固相载体，以碱性磷酸酶作为标识物，固相载体应用扩充了测定范围,检测水平可茯Pg·mL-1，重复性好。

检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第31页32五、相关仪器介绍ADVIACENTAUR全自动免疫分析仪检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第32页33(一)ADVIACENTAUR检测原理利用化学发光和磁性微粒子分离技术相结合测定方法，用高敏感性吖啶酯作为化学发光标识物，以极细磁性颗粒(PMP)作为固相载体，提供最大包被面积。1．液相吖啶酯(AE)。2．固相氧化铁(Fe2O3)。包被面积大,降低了扩散时间,增加了捕捉效率检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第33页34

(二)ADVIACENTAUR反应类型

1．双抗体夹心法检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第34页352．竞争法包含AE标识抗原法和AE标识抗体法。检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第35页363．捕捉法

常见来检测样本中特异性抗体，又称为抗体捕捉法。试剂中使用了一个抗人免疫球蛋白抗体。抗体捕捉法通常使用两次温育和洗涤，第一次温育和洗涤是为了除去样品中过多干扰物质；第二次温育和洗涤是为了检测样品中抗体。检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第36页37第二节电化学发光免疫分析电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)是对电极施加一定电压进行电化学反应，反应产物之间或体系中某种组分发生化学发光，用普通化学伎俩测量发光光谱及强度从而对物质进行痕量分析一个方法。电化学发光免疫分析(electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA)是将ECL和免疫反应(抗原抗体反应)融为一体标识免疫分析技术,是一个在电极表面由电化学引发特异性化学发光反应.检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第37页38一、基础原理检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第38页39技术特点1．ECLIA为非核素方法，可防止核素放射性污染2．为均相免疫测定技术，检测中不需要分离结合相和游离相，操作简便3．磁性微珠包被技术应用使检测灵敏度更高、线性范围更宽、反应时间更短。4．标识物Ru

稳定性好，室温下半衰期大于1年，所标识蛋白活性在2～4℃也可保持1年：以上。5．标识物可进行化学修饰，以形成易于和蛋自、半抗原及核酸等分子结合活性NHS酯或磷酰胺基团，可用于各种分析物检测。6．标识物相对分子质量小，在一个抗体分子上可同时标识许多标识物分子而不影响抗体免疫学活性，也可用于核酸标识而不影响探针杂交活性。7．标识物再循环利用使发光反应时间更长、发光强度更高，更易于测定。8．仪器没计使操作较为简便，更易于实现自动化。检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第39页40二、标识物钌衍生物，分子结构简单、稳定、相对分子质量小、水溶性强、空间位阻小等特点，可与待测物质进行全量反应．使得ECLIA测定含有高效性与稳定性且没有噪声干扰。三联吡啶钌检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第40页41第三节时间分辨荧光免疫分析法一、基础原理抗原抗体反应荧光物质标识

时间分辨技术++原理：检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第41页42用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物(代替荧光物质、放射核素或酶)，经过双功效基团螯合剂与蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞以共轭双键结合进行标识，待反应体系(如抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞杀伤反应等)发生后，三价稀土离子螫合物能够在紫外光激发下，发出强度高(波长为613nm左右)、连续时间长(10～l000μs)荧光，利用延缓测量时间，待样品中蛋白质等背景荧光完全淬灭后，再测量三价稀土离子螯合物特异荧光，依据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物浓度，到达定量分析目标检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第42页43时间分辨技术消除背景荧光:

在检测样品中，含有各种蛋白质和其它化合物，这些物质在较大波长范围内都可产生自发荧光,寿命短.

镧系离子荧光寿命很长（10us～1.0ms），比背景荧光长3～4个数量级。所以应用荧光时间分辨技术在背景荧光已经降到很低时再开始检测稀土鳌合物荧光，从而消除了非特异性荧光干扰。解离-增强原理:

较大Stocks位移（即激发光波长与发射光波长之差）和较窄发射峰等都增大了检测信噪比;特点：检验技术化学发光和荧光免疫技术和仪器第43页44二、标识物和螯合剂1．TRF