培美曲塞二钠与吉非替尼对肺腺癌细胞放射增敏作用及机制研究

培美曲塞二钠与吉非替尼对肺腺癌细胞放射增敏作用及机制研究

肺癌是世界上发病率最高的肿瘤。在中国，发病率和死亡率是第一位。目前增强放射敏感性的手段主要有改善组织乏氧状态、抑制端粒酶、干扰微管蛋白功能以及激活细胞凋亡途径等目前培美曲塞二钠和吉非替尼用于非小细胞肺腺癌的治疗,但培美曲塞二钠和吉非替尼能否与放射治疗结合提高放射敏感性及其机制均鲜见报道。因此,本研究对培美曲塞二钠和吉非替尼单独和联合放疗对人肺腺癌A549细胞增殖、克隆形成能力等进行比较,通过对比细胞周期、Akt信号通路活化水平的变化探讨其放射增敏作用和机制,为肺癌的综合治疗提供新的治疗策略。1材料和方法1.1生物科技发展有限公司人肺腺癌细胞株A549、AnnexinV-FITC/PI检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒、蛋白提取试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)。RPMI1640培养基(Gibco公司,美国),小牛血清(CS,杭州四季青生物工程材料有限公司),二甲基亚砜(DMSO,上海久亿化学试剂有限公司),四甲基偶氮唑盐(MTT,Amresco公司,美国),p-Akt、Akt单克隆抗体(Bioworld公司,美国)。1.2方法1.2.1细胞培养和群体培养A549细胞在含10%CS的RPMI1640培养液,37℃、5%CO1.2.2mtt实验制备单细胞悬液,按5×101.2.3催化剂的使用及疗效评价接种细胞至6孔板,每孔1000个细胞,培养24h贴壁后,进行分组处理,分为Control、P组、G组、P+G组、RT组、P+RT组、G+RT组、P+G+RT组。培美曲塞二钠和吉非替尼药物作用浓度分别为29.154ng/mL、0.015μmol/L,空白对照组及放疗组均加入对照溶媒,加入含药物的培养液2h后放疗,照射剂量分别为0、1、2、4、6、8Gy。每个浓度及组内设5个复孔。处理结束后继续培养48h,弃去含药物的培养液,换完全培养液,培养10~14d。当6孔细胞培养板中出现肉眼可见的克隆时,弃培养液,PBS洗涤2次,加纯甲醇溶液固定15min。弃固定液,加适量Giemsa应用液染色10~30min,洗去染色液,计数各孔细胞数>50个的细胞集落数。计算存活分数(单纯放疗组以空白对照组克隆数计算贴壁率,放疗联合药物作用组以单独药物作用组克隆数计算贴壁率),绘制剂量效应曲线。贴壁率(platingefficiency,PE)=对照组每孔克隆数/每孔细胞种植数×100%;存活率或存活分数(survivingfraction,SF)=实验组每孔克隆数/(每孔种植数×贴壁率)。以单击多靶数学模型拟合细胞存活曲线,计算出放疗组和放疗联合药物组的平均致死剂量(D0)值,放射增敏效应以放射增敏比(sensitivityenhancedratio,SER)表示,定义为单独放疗组与放疗联合药物组的D0之比。1.2.4阴性对照组构建将对数生长期的细胞消化接种到6孔板中,待细胞贴壁后根据组别设置加入相应的含药培养基,同时设立阴性对照组,每个浓度及组内设5个复孔。药物作用72h后,用PBS洗涤并收集细胞,采用AnnexinV-FITC/PI检测试剂盒双染,避光放置10min,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。收集细胞加入400μLPI染色混匀,4℃避光30min,流式细胞仪检测细胞周期分布。1.2.5膜与辣根过氧化物酶将变性完全的蛋白样品按70μg/孔加入聚丙烯酰胺凝胶(SDS),电泳100min后,恒流200mA转膜,5%脱脂奶粉封闭液中室温孵育1h封闭。加入一抗(1∶400稀释),4℃轻摇过夜,PBST缓冲液洗膜4次,每次10min。将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5000稀释)室温下摇荡孵育1h,PBST洗膜4次,每次10min。将显影液加于PVDF膜上,室温放置1min。暗室中覆盖感光胶片,根据荧光强度决定曝光时间。1.3统计学处理所有实验重复3次,运用SPSS17.0统计软件分析。数据用均数±标准差(ue0af±s)表示。实验组与对照组比较使用方差分析,P≤0.05为差异有统计学意义。2结果2.1体外生长抑制曲线不同浓度P组、G组刺激A549细胞72h的体外生长抑制曲线见图1。培美曲塞二钠和吉非替尼对肺癌细胞的抑制作用均呈剂量依赖性,计算出培美曲塞二钠和吉非替尼的IC2.2细胞曲线拟合根据MTT实验,培美曲塞二钠、吉非替尼对A549细胞均有抑制作用,随剂量增加而增强。培美曲塞二钠、吉非替尼的后续实验浓度为29.154ng/mL、0.015μmol/L。单纯放射组、培美曲塞二钠、吉非替尼单药或联合放射组细胞SF及克隆形成随着照射剂量的升高而降低(图2),使用单击多靶模型对SF和放射剂量进行曲线拟合(图3)。根据拟合的细胞存活曲线及相关公式,得出相应参数D0、准阈剂量(Dq)、SER值,P+RT组、G+RT组、P+G+RT组的Dq、2Gy照射时的存活分数(SF2)值均低于RT组,提示培美曲塞二钠、吉非替尼均可使A549细胞的放射敏感性明显增强,其SER为1.17和1.48;两者联合应用能明显增强放射作用,SER为2.62(图4)。2.3培美曲塞二钠、吉非替尼增加放射线诱导的凋亡为研究培美曲塞二钠、吉非替尼两药联合作用进一步提高放射线对A549细胞放射增敏效应的可能机制,用流式细胞仪检测各组细胞经不同处理后的细胞凋亡改变。培美曲塞二钠和吉非替尼均可增加放射线诱导的凋亡[(18.54±2.06)%vs.(8.98±0.65)%,P<0.05;(23.78±2.08)%vs.(8.98±0.65)%,P<0.05],但两药联用可以使凋亡率达到最高[(36.0±2.74)%vs.(8.98±0.65)%,P<0.05],提示两药联合可以进一步提高放射线诱导的凋亡(图5)。2.4培美曲塞二钠、吉非替尼能力模型小鼠血清gp/g期细胞比例用流式细胞仪检测各组细胞经不同处理72h后细胞周期的比例(图6)。与Control组相比,P组和G组均导致G1/G0期细胞比例增加[(54.42±0.28)%vs.(18.60±0.95)%,P<0.05;(63.62±0.27)%vs.(18.60±0.95)%,P<0.05];P+G组G1/G0期细胞比例进一步升高[(80.17±0.32)%vs.(18.60±0.95)%,P<0.05]。同时S期和G2/M期细胞比例降低,P、G及P+G组均导致S期细胞比例降低[(19.53±0.50)%vs.(30.04±1.35)%,P<0.05;(17.18±0.46)%vs.(30.04±1.35)%;(10.76±0.45)%vs.(30.04±1.35)%,P<0.05];P组G2/M期细胞比例有所降低[(26.05±0.61)%vs.(51.36±1.21)%,P>0.05];G及P+G组G2/M期细胞比例明显下降[(19.20±0.34)%vs.(51.36±1.21)%,P<0.05;(9.07±0.31)%vs.(51.36±1.21)%,P<0.05]。RT组G1/G0期、S期、G2/M期比例分别为(28.98±1.06)%、(21.73±1.13)%及(49.29±1.42)%。P+RT组、G+RT组、P+G+RT组G1/G0期细胞比例均明显增加[(68.66±0.39)%vs.(28.98±1.06)%,P<0.05;(77.94±0.37)%vs.(28.98±1.06)%,P<0.05;(90.84±0.37)%vs.(28.98±1.06)%,P<0.05]。同时P+RT组、G+RT组、P+G+RT组S期细胞比例均明显降低[(13.22±0.32)%vs.(21.73±1.13)%,P<0.05;(11.28±0.42)%vs.(21.73±1.13)%,P<0.05;(3.08±0.39)%vs.(21.73±1.13)%,P<0.05]。与RT组比较,P+RT组、G+RT组、P+G+RT组G2/M期细胞比例也明显降低[(18.12±0.42)%vs.(49.29±1.42)%,P<0.05;(10.78±0.42)%vs.(49.29±1.42)%,P<0.05;(6.08±0.38)%vs.(49.29±1.42)%,P<0.05]。以上结果表明,培美曲塞二钠和吉非替尼可以使细胞阻滞在G1/G0期;联合放射线后,S期细胞比例减少,两药合用时更明显。2.5培美曲塞二钠、吉非替尼对耐药组akt磷酸化水平的影响各组Akt蛋白质的表达无明显差异。与Control组相比,P组p-Akt/Akt比值有所降低(0.623±0.010vs.0.766±0.033,P>0.05)。G组和P+G组p-Akt/Akt比值明显降低(0.474±0.005vs.0.766±0.033,P<0.05;0.465±0.005vs.0.766±0.033,P<0.05);RT组p-Akt/Akt比值与Control组相比有所降低(0.586±0.015vs.0.766±0.033,P>0.05)。与RT组比较,P+RT、G+RT及P+G+RT组p-Akt/Akt比值明显降低(0.477±0.002vs.0.586±0.015,P<0.05;0.368±0.002vs.0.586±0.015,P<0.05;0.292±0.002vs.0.586±0.015,P<0.05,图7)。以上结果表明,培美曲塞二钠和吉非替尼可以使Akt磷酸化水平减低;与放射线联合作用后,Akt磷酸化水平仍进一步减低,两药合用时更明显。3放射线抑制剂与培美曲塞二钠、吉非替尼的联用肺癌是一种危害极其严重的恶性肿瘤,已成为各种肿瘤死亡的首要原因,发病率和死亡率呈逐年上升趋势。手术治疗、放疗、化疗是肿瘤治疗中最传统的3种方法,其中放疗在肺癌治疗过程中占据着不可替代的重要地位。随着放射治疗技术和设备的改善和提高,治疗效果有了一定程度地提高,但并没有显著性改善,仍有多数肿瘤存在一定的放射抵抗,即使用最大可能的照射剂量或改变照射方法,临床上放射野内复发的情况依旧存在。放射抵抗的成因是多方面的,其中最重要的是由于实体肿瘤中普遍存在10%~50%的乏氧细胞,其对射线有抵抗作用,一般比有氧细胞强2.5~3.0倍,这限制了肿瘤放疗的效果。为了增加乏氧细胞对放射的敏感性,曾进行了很多努力和尝试,比如加大放疗剂量、使用乏氧细胞增敏剂、放疗和化疗药物联合应用等培美曲塞二钠是一种结构上含有核心为吡咯嘧啶基团的抗叶酸制剂,通过破坏细胞内叶酸依赖性的正常代谢过程,抑制细胞复制,从而抑制肿瘤生长。体外研究显示,培美曲塞二钠可抑制胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶和甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶的活性,这些酶均是合成叶酸所必需的酶,参与胸腺嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸的生物再合成过程,培美曲塞二钠通过运载叶酸的载体和细胞膜上的叶酸结合蛋白运输系统进入细胞内。培美曲塞二钠进入细胞后,在叶酰多谷氨酸合成酶的作用下转化为多谷氨酸的形式,存留于细胞内成为胸苷酸合成酶和甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶的抑制剂。多谷氨酸化在肿瘤细胞内呈现时间-浓度依赖性过程,而在正常组织内浓度很低,其代谢物在肿瘤细胞内的半衰期延长,从而延长了药物在肿瘤细胞内的作用时间。临床前研究显示培美曲塞二钠体外可抑制多种肿瘤细胞生长,包括白血病、肺癌、间皮瘤、乳癌、结肠癌以及卵巢癌等,并对多种类型的瘤株呈现剂量依赖性的抗瘤活性,在与其他抗肿瘤化疗药物联用时也显示出较好的抗瘤活性吉非替尼为酪氨酸激酶抑制剂小分子化合物,主要通过与三磷酸腺苷竞争结合至EGFR胞内酪氨酸激酶功能域,抑制受体自磷酸化,阻止下游信号转导,最终产生抗肿瘤作用。一些研究发现,放疗可提高EGFR表达,加用分子靶向类药物可提高放疗疗效培美曲塞二钠和EGFR抑制剂(吉非替尼)目前广泛应用于肺腺癌的治疗,但培美曲塞二钠和吉非替尼能否与放射治疗结合,提高放射敏感性;是否能成为新的有效的放射增敏剂,以及放射增敏的机制等鲜见报道。本研究采用MTT、克隆形成、流式细胞术等方法,对培美曲塞二钠和吉非替尼单独和联合放疗对人肺腺癌A549细胞增殖、克隆形成能力等进行比较,发现培美曲塞二钠和吉非替尼具有抑制人A549细胞增殖的作用,随剂量增加而增强。P+G+RT组的Dq、D0及SF2均明显低于RT组,P+RT组及G+RT组SER分别为1.17和1.48,P+G+RT组S