马立克氏病病毒meq基因细菌人工染色体序列自我敲除的分子鉴定

马立克氏病病毒meq基因细菌人工染色体序列自我敲除的分子鉴定

马丽斯病（md）是由马丽斯病病毒（mdv）引起的一种鸡感染肿瘤，主要由淋巴结增多和肿瘤形成引起。尽管如此,CVI988/Rispens逐渐不能提供完全的免疫保护,近年来,国内免疫CVI988/Rispens的鸡群,MD肿瘤发生率也有上升的趋势Petherbridge等1材料和方法1.1质粒、培养基和试剂常规方法制备原代鸡胚成纤维细胞(chickenembryofibroblasts,CEF);含有cre重组酶表达盒的SC9-1重组质粒由山东农业大学家禽肿瘤病实验室构建并保存;荧光定量染料、pMD18-T载体和脂质体2000均购自宝生物工程(大连)有限公司;细胞培养基购自Invitrogen公司;凝胶回收试剂盒购自Omega公司;细菌培养基购自Oxoid公司;其他常规试剂均为国产分析纯。1.2sc9-1不同代次病毒中bac序列的pcr检测1.2.1SC9-1重组病毒的拯救及鉴定利用脂质体2000将含有cre重组酶表达盒的SC9-1重组质粒转染进CEF细胞,拯救SC9-1重组病毒。具体步骤:将1μgSC9-1重组质粒加入100μLoptiMEM,10μL脂质体2000加入100μLopti-MDM,室温静置5min,将两种溶液混匀,室温放置20min,加入opti-MDM补至1mL。将溶液加入已长成单层CEF细胞的6孔板中转染,放置37℃、5%CO1.2.2SC9-1重组病毒在细胞上的传代及BAC序列的PCR检测将拯救的SC9-1重组病毒利用原代CEF细胞进行连续传代培养,直至第10代。SC9-1重组病毒基因组中的cre重组酶在CEF细胞内表达,将两个loxp位点间的BAC序列敲除掉,随着病毒传代,所有病毒基因组中的BAC序列均被完全敲除。在病毒传代过程中,利用苯酚-氯仿提取每代病毒DNA。以SC9-1基因组中的BAC序列为模板设计引物(BAC-F:5′-TGGCACCCTACAGGAACA-3′;BAC-R:5′-TGACGAACCACCCTCAAA-3′),并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,扩增BAC序列600bp的特异性片段。利用上述特异性引物检测不同代次病毒DNA中是否含有BAC序列。1.2.3不同代次病毒DNA中的BAC序列的荧光定量PCR检测设计针对BAC序列gpt基因的特异性荧光定量PCR检测引物(gpt-F:5′-AGCGCACTTTGTCACCATCT-3′;gpt-R:5′-TATCCCACGGCTGTTCAATC-3′),以MDV独特保守基因pp38作为内参基因设计引物(pp38-F:5′-TTCGCATACCGACTTTCGTC-3′;pp38-R:GAGCTAACCGGAGAGGGAGA),引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。利用荧光定量PCR检测不同代次病毒DNA中的BAC序列含量,进一步分析BAC序列在病毒传代过程中的动态变化。1.2.4SC9-1基因组中BAC序列敲除的PCR鉴定SC9-1的BAC序列敲除后剩余1个loxp位点,分别在loxp位点两端的sorf3、US2基因处设计引物(S-F:5′-GTCCCACCTGTTTCATCTTC-3′;S-R:5′-GTAATGCTCCACATAGCTTAT-3′),并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以提取的1~10代病毒DNA为模板扩增包含loxp位点的1197bp的序列。将PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳纯化后,连接pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,每代病毒DNA的PCR产物挑取至少12个阳性克隆送往宝生物工程(大连)有限公司进行测序。通过多个克隆测序结果验证SC9-1基因组中BAC序列的敲除并进一步分析BAC序列在敲除过程中残留位点序列的单一性。2结果与分析2.1mdv特有的蚀斑利用脂质体2000将SC9-1重组质粒转染CEF细胞,7d后出现MDV特有的蚀斑。以MDVBA4单克隆抗体作为一抗进行IFA检测,结果显示拯救病毒呈现特异性的亮绿色,而空白CEF细胞没有荧光(图1),结果表明成功拯救SC9-1重组病毒。2.2cr检测结果利用BAC序列的特异性检测引物以1~10代病毒DNA为模板进行PCR检测。结果显示,1~5代病毒DNA为模板均能扩增600bp的特异性目的条带,从第6代病毒开始均未扩增出特异性目的条带(图2)。结果表明,6~10代病毒基因组中的BAC序列完全敲除掉。2.3bac序列及mdvpp42基因表达与cef细胞的相关性以MDVpp38基因为内参,对病毒DNA中的BAC序列含量进行荧光定量PCR检测。结果显示,随着病毒在CEF细胞上的传代,BAC序列相对于MDVpp38基因越来越少,即相对于MDV越来越少,直至第6代病毒完全检测不到(表1)。结果同样表明,6~10病毒基因组中的BAC序列已被完全敲除掉。2.4重组病毒的鉴定对敲除SC9-1BAC序列后loxp位点两端序列的PCR结果显示,1~5代病毒DNA均能扩增出1197bp的特异性目的条带,其中第5代病毒DNA扩增电泳图见图3。结果表明从第1代病毒开始,cre重组酶已经开始敲除病毒基因组中的BAC序列。测序结果显示,每代病毒的多个克隆PCR测定序列及不同代次PCR测定序列的同源性均在99.7%以上,其中第5代PCR测定序列同源性见图4。结果表明BAC序列的敲除过程存在高度的一致性,没有其他突变序列产生。3bac序列序列的自剪切特性BAC克隆技术的应用极大促进了MDV的基因功能及致病机理的研究利用同源重组技术构建的GX0101的meq基因缺失株SC9-1,完全丧失致病性,不再引起免疫抑制,且能提供比商品化疫苗CVI988/Rispens更好的免疫保护效果cre同源重组酶的真核表达盒插入SC9-1的BBAACC序列中,随着病毒在CEF细胞上的传代,表达的的同同源重组酶逐渐的将两个loxp位点间的序列剪切切掉掉,仅留下一个loxp位点BBAC技术相对黏粒技术构建的MDV感染性克克隆隆,病毒相对更为单一。为了进一步揭示BAC序列列的的自我剪切是否会产生较多的突变,促使病毒敲除除BBAAC序列后成为各种突变株的复合体。本试验对对病病毒传代过程中敲除BAC序列后残留的序列进行行测测序验证,每代病毒均挑选12株克隆进行测序,结结果果显示所有序列的同源性均在99.7%以上。因此此,,可可证实BAC序列在病毒传代过程中的自我剪切不不会会产生多样性,敲除BAC序列的MDV依然具