电镜超薄切片

电镜超薄切片第1页，课件共55页，创作于2023年2月第2页，课件共55页，创作于2023年2月第3页，课件共55页，创作于2023年2月第4页，课件共55页，创作于2023年2月冷冻蚀刻法超薄切片第5页，课件共55页，创作于2023年2月冷冻蚀刻法冷冻割断术第6页，课件共55页，创作于2023年2月细胞化学法第7页，课件共55页，创作于2023年2月免疫组织化学技术免疫电镜法第8页，课件共55页，创作于2023年2月电镜放射自显影术放射自显影技术第9页，课件共55页，创作于2023年2月扫描电镜技术被吞噬的红细胞第10页，课件共55页，创作于2023年2月现有的透射电镜生物制品制备技术分为两类：一类是透射电镜的基本制备技术，包括超薄切片和负染色法；另一类是生物制品的特殊技术，其中包括冷冻蚀刻法、冰冻割断术、细胞化学法、免疫电镜法、放射自显影技术、X线微区分析技术等。第11页，课件共55页，创作于2023年2月1、

超薄切片样品的制备（1）

取材基本要求是在活体情况下进行取材的原则(快、准、轻、小、冷的原则）1）

快速：1分钟之内投入固定液。2）

块小：0.5-1mm3或截面1mm2的长条。3）

部位准4）

损伤小：器械应锐利，避免牵拉、挤压，防止组织受机械损伤。5）

低温：0-4oC第12页，课件共55页，创作于2023年2月取材的方法1）动物材料：对神经组织等要进行原位固定或灌注固定，待组织适当硬化后再取材。第13页，课件共55页，创作于2023年2月胚胎干细胞的研究第14页，课件共55页，创作于2023年2月2）培养细胞：生长在瓶中的细胞到足够的量，先倒去培养液，然后倒入适量的戊二醛固定液，在冰浴下3-5分钟、弯头吸管吹打或用软器械轻轻地刮下贴壁的细胞，将这种混合液倒入离心管中，2000rpm低速离心15-20分钟，使细胞呈团，弃去上清液，换一次固定液，将其移入修块台，修快成标准块4oC固定、待用。第15页，课件共55页，创作于2023年2月3）单细胞悬液：精子、血球等其他不易聚集的悬浮游离材料，可加入等量的戊二醛和其他类型的固定液，轻轻地把他们悬浮在固定液中。经过固定处理后再离心成团，在50oC中弃去上清液，加入适量的经50oC预温的2%的琼浆，使团悬浮，将悬浮团和琼脂液一同在薄片上展层，固定后切成1mm3的小块。第16页，课件共55页，创作于2023年2月（2）固定固定的目地是把细胞在活体状态时的结构尽可能完整的保存下来，避免自身酶的分解而出现自溶，或外界微生物的侵入而产生腐败，致细胞的超微结构破坏。第17页，课件共55页，创作于2023年2月1）固定液的作用

A．阻止细胞自溶。B稳定细胞物质成分。C在一些组分的分子之间以化学反应和物理反应建立铰链，提供一个骨架来稳定各种细胞的空间结构。D能提供一定的电子反差

第18页，课件共55页，创作于2023年2月

理想的固定剂，应具备以下条件：①能迅速而均匀地渗入组织细胞内部，稳定细胞内各种成分；②能即刻将细胞“杀死”，尽可能保持细胞微细结构，减少死后变化；③对细胞不产生收缩及膨胀作用，不产生人工假象及变形；④可保存酶的活性，以利于细胞化学测定工作的进行。第19页，课件共55页，创作于2023年2月2）影响固定效果的因素固定液的酸碱度(pH值)①固定液的pH值②渗透压③缓冲液的类型④固定的温度和时间当前采用的是在0～4℃下固定1～4小时。第20页，课件共55页，创作于2023年2月3）常用的几种固定剂A四氧化锇（osmiumtetroxide,OsO4）亦称锇酸：锇酸实际上不是酸，它的水溶液是中性的，为一种强氧化剂。0.5-1g包装，淡黄色晶体。具有挥发性和毒性，在室温下易挥发，其蒸气对粘膜有刺激作用，在通风橱内径相配制。第21页，课件共55页，创作于2023年2月

优点①对蛋白质和脂类固定较好。②对作为细胞骨架的磷酸脂蛋白的作用好，对核蛋白保护作用很好，因为在有机体内核酸和碳水化合物与蛋白制成复合的形式，因此锇酸几乎和所有的细胞成分结合。③分子密度高，产生良好的反差，因此锇酸固定本身也起到生物染色作用。缺点①不能固定糖元和核酸，对微管固定较差。②扩散慢，穿透能力差。③具有挥发性和粘膜毒性。④不适于进行细胞化学工作。第22页，课件共55页，创作于2023年2月B戊二醛（glutaraldehyde,C5H8O2）纯的容易聚合，目前使用25%水溶液进口分装。存放时间久了容易变质，影响固定。优点(1)对组织穿透力强。(2)能保存某些酶的活性，对糖元、细胞膜、核基质等有较好的作用。(3)而且组织块在溶液中可保存较长的时间，适用于进行超微细胞化学研究。第23页，课件共55页，创作于2023年2月C甲醛（fomaldehyde）:多用多聚甲醛粉剂配制。其分子小，渗透力强，固定迅速，对酶的活性保存好。第24页，课件共55页，创作于2023年2月第25页，课件共55页，创作于2023年2月2）固定的方法A单固定法：对单细胞或固定液易于浸透的组织，一般单独用1-2%四氧化锇固定液固定1-2小时可达到固定的目地。B双固定法：戊二醛（2.5%4oC2h）---锇酸（1%4oC2h）。C原位固定和灌注固定：将动物麻醉、解剖进行原位固定。灌注固定：通过血液循环将醛类的固定液灌流到所需组织中。神经组织、视网膜、肾脏。第26页，课件共55页，创作于2023年2月附几种常见固定剂的配制固定液的PH值6.0-8.0，常用PH值7.2-7.4,对含水较多的组织可用PH值8.0，细菌、病毒可用PH值在7.0以下。0.

2mol/L磷酸缓冲液的配制磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O）2.6g

磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）29g重蒸水加到500ml

调PH到7.4第27页，课件共55页，创作于2023年2月0.2mol/L二甲坤酸盐酸缓冲液重蒸水25ml二甲坤酸钠（Na(CH3)2AsO2.3H2O）2.14g0.

1mol/L盐酸8ml重蒸水加至50ml调PH到7.4

第28页，课件共55页，创作于2023年2月B固定液的配制锇酸固定液的配制2%的锇酸固定液的配制：清洗烘干器皿--1G锇酸+50ml双蒸水（棕色瓶）数日可用。0.1mol/L磷酸盐缓冲液或二甲坤酸盐缓冲液配制的1%锇酸固定液。2%的锇酸缓冲液10ml0.2mol/L缓冲液10ml调节PH应为7.3-7.4第29页，课件共55页，创作于2023年2月戊二醛固定液的配制25%戊二醛（ml）0.411.6重蒸水（ml）4.643.40.2ml/L缓冲液（ml）555戊二醛最终浓度12.54调节固定液PH值到7.3-7.4第30页，课件共55页，创作于2023年2月（3）

脱水1）

清洗:固定后均用和固定液相同的缓冲液冲洗3次，每次15分钟2）

脱水：常用的脱水剂为乙醇和丙酮。乙醇引起组织中脂类物质抽提较丙酮少，且不会使组织变硬、变脆，故为常用脱水剂，然乙醇不容易和用于包埋剂的环氧树脂相混溶，因此在进入包埋剂之前常用中间剂环氧丙烷置换。第31页，课件共55页，创作于2023年2月脱水程序如下表浓度50%70%90%100%时间10′-15′10′-15′10′-15′3次（每次10′-15′）温度4oC4oC转室温室温第32页，课件共55页，创作于2023年2月经验：①脱水剂临时配制。②浓度梯度上升。③脱水时间和浓度。④脱水时的连续性。⑤脱水剂的选择。第33页，课件共55页，创作于2023年2月（4）浸透：其目的是通过脱水剂稀释包埋剂，最终让包埋剂取代脱水剂，使其渗透到组织中去。

脱水和包埋剂的比例2:11:2纯包埋剂时间1-2h2-3h2h温度室温室温37oC温箱第34页，课件共55页，创作于2023年2月经验：①浸透时间。②浸透温度。第35页，课件共55页，创作于2023年2月（5）

包埋：目的:包埋的目的是让包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬的固体，成为细胞结构的支架，能够承受切片的各种力的作用，有利于切薄片。包埋剂的性质:①粘度适中，有良好的切割性能。②能耐受电子束的轰击，高温不易升华、不变形。③透明度好。④对人无害。第36页，课件共55页，创作于2023年2月包埋剂的种类①环氧树脂类：目前国内使用较多的环氧树脂有进口的Epon812和国产的618。原理:环氧树脂具有环氧基和羟基两个主要化学反应基团，环氧基是线型聚合物的末端，易与其它含活性氢原子的化合物如胺类反应，形成首尾相接的长链状聚合物。而单体中的羟基能与酸酐结合，形成分子间的横桥连接。因此，将环氧树脂、胺类和酸酐三者按比例混合，在一定温度条件下，可形成具有三维空间结构的交链状聚合物。第37页，课件共55页，创作于2023年2月这种聚合物收缩率小、均匀，组织损伤小，耐电子束的轰击。包埋后可保存细胞内的微细结构。其缺点是粘度较大，操作不便、切片较为困难，而且反差较弱。第38页，课件共55页，创作于2023年2月②低粘度包埋剂(Spurr)

为适应临床诊断电镜的需要，目前低粘度包埋剂的应用已日趋广泛。这是一种低粘度的树脂，能较好地渗入组织内部，对组织结构保存好，耐电子束轰击，可广泛应用于各种生物材料，尤其适宜于较致密的组织。第39页，课件共55页，创作于2023年2月③水溶性包埋剂：

是进行细胞化学研究较理想的包埋剂。

原理:水溶性包埋剂可以在较低温度的紫外线照射下进行聚合，避免了一般包埋剂必须在高温下聚合而给酶活性带来的破坏，所以是酶活性定位和定量研究十分优良的包埋剂。包埋剂:DurcuPan、乙二醇甲基丙烯酸脂(简称GMA)、聚乙二醇、Aquon等第40页，课件共55页，创作于2023年2月④所加的固化剂，有十二烯基虎铂酸酐（DDSA）和甲基内次甲基四氢苯二甲酸酐（MNA）,增韧剂为邻苯二甲酸二丁酯（DBP）,加速剂为2,4,6,一三苯酚（DMP—30）。第41页，课件共55页，创作于2023年2月1）

环氧树脂的性能和配制：618树脂5ml十二烯基丁二酸酐DSA（固化剂）5ml苯二甲酸二丁酯DBP（增塑剂）0.3ml2,4.6三苯酚称DMP30（加速剂）0.1ml60oC烘箱内加温使粘度下降，用量杯量取所需要的量，一次加入固化剂、增塑剂、加速剂，边加边搅拌，最后充分搅拌10分钟，至37oC温箱中使气泡逸出。

第42页，课件共55页，创作于2023年2月Epon812的配制A液：Epon81262mlDDSA(固化剂)100mlB液：Epon812100mlMNA(固化剂)89mlA液和B液分别配制，使用时用不同比例将二者混合后再加1.5%DMP-30(加速剂)即可。A液和B液的比例：冬季2：8。夏季1：9。B液可以增加包埋块的硬度。第43页，课件共55页，创作于2023年2月1）

包埋的方法第44页，课件共55页，创作于2023年2月常规包埋①

将浸透在包埋剂的组织块，转移到包埋囊中，使之位于囊的中央，然后加包埋剂。②

把写好标本块编号的小纸条卷成环状，放入囊中，插入包埋剂中。③

不加盖，37oC过夜，这也就是纯包埋剂浸透。④

次日，升温到60oC48小时固化。⑤

固化完毕，关温箱，自然冷却。⑥

去掉外壳，取出组织包埋块将组织包埋块，存放在干燥器中。

第45页，课件共55页，创作于2023年2月定向包埋：注意事项①防潮、干燥。②包埋剂要充分混匀。③防气泡。④包埋后立即清洗器皿。⑤自身保护。⑥干燥器中存放包埋块。

第46页，课件共55页，创作于2023年2月（6）切片1）选择和清洗载网。常用的载网有圆形的铜网，细胞化学和免疫组织化学常用镍网、不锈钢网和银丝网。直径为3mm，目数为200-300

第47页，课件共55页，创作于2023年2月2）

支持膜的制备：①

福尔莫瓦膜：常用氯仿配制的0.2%-1.5%的聚乙烯醇缩甲醛液（formrar）。注：制膜时室内的温度小于60%，否则会出现白点。②

火棉胶膜：特点，火棉胶膜的机械强度比福尔莫瓦膜弱，但制作容易。常用1-2%醋酸异戊酯溶液采用漏斗法和贴附法制膜。③

帕罗丁支持膜：目前国外比较常用，一般配制30%左右的帕罗丁醋酸戊酯溶液制膜，方法同火棉胶同。④

碳膜：炭膜的机械程度和稳定性较好，适用于高分辨率的观察，用真空喷镀仪采用碳升华喷镀法制备。⑤

复合膜：有机膜上喷镀5-10nm的碳膜。⑥

微孔支持膜：高分辨率观察使用。第48页，课件共55页，创作于2023年2月2）

包埋块修整：修成四面锥体（45oC角）第49页，课件共55页，创作于2023年2月5）超薄切片机的构造

6）切片操作

7）

切片厚度:灰色40-50nm

银灰色50-70nm

金黄色70-90nm

紫色90nm以上第50页，课件共55页，创作于2023年2月(7)染色1）

常用的电子染色剂醋酸铀(UO2(CH3COO)2.2H2O：特性：具有放射性和毒性，对光不稳定，储存、染色最好闭光，变混则失效。广泛使用，能产生较高的反差。主要是提高核酸、核蛋白和结缔组织纤维成分的反差；对糖分、分泌颗粒、溶酶体等也能染色，但对膜的结构染色较差。常用浓度：50%-70%的乙醇或丙酮配制的2%-3%的溶液。染的时间：组织块染色时间为1-2h或过夜。片染30min